MiR-345在前列腺癌雄激素非依賴性進程中作用的研究.pdf

1、[背景]
　　 前列腺癌(prostatecancer，PCa)在西方國家是老年男性最常見的惡性腫瘤之一。美國癌癥協(xié)會估計2012年美國男性將新發(fā)癌癥病例848170例，其中前列腺癌占居首位(29％)；男性癌癥死亡病例301820例，前列腺癌占9％，位居第二位。近年來，在我國隨著普遍醫(yī)療水平的提高以及社會的老齡化，前列腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，嚴重影響著我國50歲以上男性的生活質(zhì)量和預期壽命。預計到2020年，我國前列腺

2、癌的發(fā)病率將高達40/10萬，年新發(fā)病例達35萬，與肝癌的發(fā)病率相當。前列腺癌已成為世界性的公共健康問題。前列腺癌臨床上可分為局限性前列腺癌和晚期前列腺癌兩種，其治療方法也根據(jù)此兩種類型劃分為觀察監(jiān)測、根治性手術及雄激素剝奪治療。對于不能行手術治療的晚期前列腺癌患者，目前標準治療方法仍是采用激素阻斷治療聯(lián)合放化療。這種方法早期一般是有效的，此時稱激素依賴性前列腺癌(ADPC)，其有效率一般可達70％～80％，然而，大多數(shù)腫瘤2年內(nèi)復發(fā)并

3、進展為具有高侵襲、增殖等惡性能力更高的激素非依賴性前列腺癌(AIPC)。一旦進入此階段，幾乎任何臨床治療方法都療效甚微，此期患者病情不可遏制的急劇惡化，腫瘤迅速轉(zhuǎn)移侵襲其它器官，最終導致患者死亡。因此，研究前列腺癌細胞在去雄激素環(huán)境下生長、增殖、侵襲能力的變化及其機制，可為臨床上前列腺癌的診斷及治療提供新的策略。
　　 miRNA是近年來在多種真核細胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類來源內(nèi)源性染色體上的非編碼單鏈RNA，長度為21～25nt的

4、短序列，通過與靶mRNA3’UTR完全或不完全的互補結合在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控，影響細胞增殖、分化和凋亡，在生命活動中發(fā)揮重要作用，并可通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程。通過生物信息學預測，人體內(nèi)有將近30％左右的基因受到miRNA的調(diào)節(jié)，特別是那些處在信號轉(zhuǎn)導通路上的分子更是miRNA的調(diào)節(jié)靶基因。最近研究表明一些miRNA在前列腺癌組織中異常表達，miRNA在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制中起著

5、重要作用。miRNA的發(fā)現(xiàn)和研究為理解基因的表達和功能提供了新的思路，前列腺癌相關的miRNA有望成為臨床前列腺癌診斷、治療和預后判斷的重要分子標志物。
　　 [目的]
　　 針對ADPC和AIPC的病例標本，進行miRNA芯片篩選，建立前列腺癌雄激素阻斷治療后，兩個重要階段的miRNA表達譜數(shù)據(jù)庫，并通過細胞模型進行驗證；選取差異表達顯著miR-345作為本實驗的研究對象，進一步明確miR-345主要參與的調(diào)控細胞的生

6、物學功能以及探索miR-345在前列腺癌非雄轉(zhuǎn)化進程中的作用機制，為miR-345成為前列腺癌惡性進展標志物和治療靶點奠定理論基礎。
　　 [方法]
　　 1、針對ADPC和AIPC晚期前列腺癌原位標本進行miRNA表達譜分析，篩選差異表達miRNA。利用雄激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP在體外去雄誘導下長期培養(yǎng)建立雄激素非依賴性前列腺癌細胞亞系LNCaP-AI，行LNCaP及LNCaP-AI細胞系RT-PCR方法驗證

7、差異表達miRNA，同時選取差異表達顯著miR-345作為本實驗的研究對象，并測定其在前列腺各細胞系中的不同表達量，明確后續(xù)工作有研究價值。
　　 2、進行miR-345細胞功能學實驗，通過轉(zhuǎn)染人工合成的miR-345的模擬物和反義體，在LNCaP及LNCaP-AI細胞中過表達或敲除miR-345，檢測對細胞生長增殖、遷移、侵襲等功能的影響。
　　 3、進行miR-345在前列腺癌細胞中作用機制的研究，在LNCaP及LN

8、CaP-AI細胞中過表達或敲除miR-345，檢測其對細胞周期、神經(jīng)內(nèi)分泌表型及雄激素敏感性的影響，并篩選檢測其作用的靶基因。
　　 4、miR-345作為腫瘤標志物在前列腺癌患者中的血清檢測。
　　 [結果]
　　 1、利用組織芯片檢測及RT-PCR法驗證，ADPC及AIPC標本中差異表達顯著的miRNA有7個，其中表達上調(diào)的有miR-345，miR-221，miR-663，miR-222，miR-106a，表

9、達下調(diào)的有miR-29c，miR-148a。
　　 2、miR-345在人AIPC組織和ADPC組織中差異表達顯著；miR-345在前列腺正常上皮細胞RWPE-1中含量最低，在激素非依賴性前列腺癌細胞LNCaP-AI中含量最高；激素非依賴性前列腺癌細胞LNCaP-AI、PC3、C42中的含量均高于激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP。
　　 3、CCK-8檢測結果示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細胞生長增殖能力明顯增強，而

10、轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細胞生長增殖能力則明顯減弱。
　　 4、劃痕實驗結果示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細胞劃痕間距離明顯縮短，而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細胞劃痕間距離較對照組無明顯變化。
　　 5、Transwell侵襲實驗結果示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細胞穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量較對照組無明顯變化，而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細胞穿過基質(zhì)膠的細

11、胞數(shù)量較對照組也無明顯變化。
　　 6、流式細胞學檢測示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細胞S期數(shù)量較對照組明顯增加，而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細胞S期數(shù)量較對照組明顯減少。
　　 7、轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細胞去雄培養(yǎng)3天后出現(xiàn)明顯神經(jīng)內(nèi)分泌樣改變，RT-PCR檢測細胞NSE表達水平也在去雄培養(yǎng)3天后較對照組明顯升高。
　　 8、RT-PCR法檢測細胞PSA、AR表達結果示：轉(zhuǎn)染m

12、iR-345的LNCaP細胞AR表達無明顯變化，但DHT誘導的PSA表達較對照組明顯減少；而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細胞的AR表達無明顯變化，但DHT誘導的PSA表達較對照組明顯增加。
　　 9、通過生物信息學方法篩選及RT-PCR、WesternBlot驗證，發(fā)現(xiàn)miR-345通過調(diào)控CDC25B而影響細胞生長周期。
　　 10、收集ADPC及AIPC患者術前全血，利用RT-PCR法檢測前列腺癌患

13、者血清miR-345表達水平，發(fā)現(xiàn)在AIPC患者中明顯增高，且與血清PSA相關。
　　 [結論]
　　 1、通過基因芯片和細胞模型篩選出明顯差異表達miRNA7個，其中表達上調(diào)5個：miR-345、miR-221、miR-663、miR-222、miR-106a，表達下調(diào)2個：miR-29c、miR-148a。
　　 2、miR-345在人AIPC組織和ADPC組織中差異表達顯著，而且miR-345在LNCaP-

14、AI細胞系中的含量明顯高于LNCaP、PC3、C42、RWPE-1細胞系，提示miR-345可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其在前列腺癌的惡性進展、激素非依賴性轉(zhuǎn)化進程中發(fā)揮作用。
　　 3、CCK-8及劃痕實驗結果示：miR-345能明顯促進LNCaP及LNCaP-AI細胞的生長增殖，并增強LNCaP細胞的遷移能力；而且流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)miR-345能明顯增加前列腺癌S期細胞。說明miR-345在前列腺癌惡性進展中起一定促進

15、作用。
　　 4、RT-PCR法檢測NSE、PSA以及AR結果示：miR-345能明顯促進LNCaP細胞神經(jīng)內(nèi)分泌樣改變；不影響LNCaP和LNCaP-AI細胞AR受體的表達，但明顯影響AR介導的PSA表達，降低LNCaP細胞的雄激素敏感性。提示miR-345參與前列腺癌激素非依賴性轉(zhuǎn)化。
　　 5、通過生物信息學方法篩選及RT-PCR、WesternBlot驗證，發(fā)現(xiàn)miR-345通過調(diào)控CDC25B而影響細胞生長周期