MiR-345在前列腺癌雄激素非依賴性進(jìn)程中作用的研究.pdf

1、[背景]
　　 前列腺癌(prostatecancer，PCa)在西方國(guó)家是老年男性最常見的惡性腫瘤之一。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)2012年美國(guó)男性將新發(fā)癌癥病例848170例，其中前列腺癌占居首位(29％)；男性癌癥死亡病例301820例，前列腺癌占9％，位居第二位。近年來，在我國(guó)隨著普遍醫(yī)療水平的提高以及社會(huì)的老齡化，前列腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著我國(guó)50歲以上男性的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。預(yù)計(jì)到2020年，我國(guó)前列腺

2、癌的發(fā)病率將高達(dá)40/10萬(wàn)，年新發(fā)病例達(dá)35萬(wàn)，與肝癌的發(fā)病率相當(dāng)。前列腺癌已成為世界性的公共健康問題。前列腺癌臨床上可分為局限性前列腺癌和晚期前列腺癌兩種，其治療方法也根據(jù)此兩種類型劃分為觀察監(jiān)測(cè)、根治性手術(shù)及雄激素剝奪治療。對(duì)于不能行手術(shù)治療的晚期前列腺癌患者，目前標(biāo)準(zhǔn)治療方法仍是采用激素阻斷治療聯(lián)合放化療。這種方法早期一般是有效的，此時(shí)稱激素依賴性前列腺癌(ADPC)，其有效率一般可達(dá)70％～80％，然而，大多數(shù)腫瘤2年內(nèi)復(fù)發(fā)并

3、進(jìn)展為具有高侵襲、增殖等惡性能力更高的激素非依賴性前列腺癌(AIPC)。一旦進(jìn)入此階段，幾乎任何臨床治療方法都療效甚微，此期患者病情不可遏制的急劇惡化，腫瘤迅速轉(zhuǎn)移侵襲其它器官，最終導(dǎo)致患者死亡。因此，研究前列腺癌細(xì)胞在去雄激素環(huán)境下生長(zhǎng)、增殖、侵襲能力的變化及其機(jī)制，可為臨床上前列腺癌的診斷及治療提供新的策略。
　　 miRNA是近年來在多種真核細(xì)胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類來源內(nèi)源性染色體上的非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度為21～25nt的

4、短序列，通過與靶mRNA3’UTR完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，并可通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，人體內(nèi)有將近30％左右的基因受到miRNA的調(diào)節(jié)，特別是那些處在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的分子更是miRNA的調(diào)節(jié)靶基因。最近研究表明一些miRNA在前列腺癌組織中異常表達(dá)，miRNA在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制中起著

5、重要作用。miRNA的發(fā)現(xiàn)和研究為理解基因的表達(dá)和功能提供了新的思路，前列腺癌相關(guān)的miRNA有望成為臨床前列腺癌診斷、治療和預(yù)后判斷的重要分子標(biāo)志物。
　　 [目的]
　　 針對(duì)ADPC和AIPC的病例標(biāo)本，進(jìn)行miRNA芯片篩選，建立前列腺癌雄激素阻斷治療后，兩個(gè)重要階段的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證；選取差異表達(dá)顯著miR-345作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，進(jìn)一步明確miR-345主要參與的調(diào)控細(xì)胞的生

6、物學(xué)功能以及探索miR-345在前列腺癌非雄轉(zhuǎn)化進(jìn)程中的作用機(jī)制，為miR-345成為前列腺癌惡性進(jìn)展標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1、針對(duì)ADPC和AIPC晚期前列腺癌原位標(biāo)本進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，篩選差異表達(dá)miRNA。利用雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系LNCaP在體外去雄誘導(dǎo)下長(zhǎng)期培養(yǎng)建立雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞亞系LNCaP-AI，行LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞系RT-PCR方法驗(yàn)證

7、差異表達(dá)miRNA，同時(shí)選取差異表達(dá)顯著miR-345作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，并測(cè)定其在前列腺各細(xì)胞系中的不同表達(dá)量，明確后續(xù)工作有研究?jī)r(jià)值。
　　 2、進(jìn)行miR-345細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過轉(zhuǎn)染人工合成的miR-345的模擬物和反義體，在LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞中過表達(dá)或敲除miR-345，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、遷移、侵襲等功能的影響。
　　 3、進(jìn)行miR-345在前列腺癌細(xì)胞中作用機(jī)制的研究，在LNCaP及LN

8、CaP-AI細(xì)胞中過表達(dá)或敲除miR-345，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期、神經(jīng)內(nèi)分泌表型及雄激素敏感性的影響，并篩選檢測(cè)其作用的靶基因。
　　 4、miR-345作為腫瘤標(biāo)志物在前列腺癌患者中的血清檢測(cè)。
　　 [結(jié)果]
　　 1、利用組織芯片檢測(cè)及RT-PCR法驗(yàn)證，ADPC及AIPC標(biāo)本中差異表達(dá)顯著的miRNA有7個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有miR-345，miR-221，miR-663，miR-222，miR-106a，表

9、達(dá)下調(diào)的有miR-29c，miR-148a。
　　 2、miR-345在人AIPC組織和ADPC組織中差異表達(dá)顯著；miR-345在前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1中含量最低，在激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP-AI中含量最高；激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP-AI、PC3、C42中的含量均高于激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP。
　　 3、CCK-8檢測(cè)結(jié)果示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力明顯增強(qiáng)，而

10、轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力則明顯減弱。
　　 4、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細(xì)胞劃痕間距離明顯縮短，而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細(xì)胞劃痕間距離較對(duì)照組無明顯變化。
　　 5、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組無明顯變化，而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的細(xì)

11、胞數(shù)量較對(duì)照組也無明顯變化。
　　 6、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)示：轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細(xì)胞S期數(shù)量較對(duì)照組明顯增加，而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細(xì)胞S期數(shù)量較對(duì)照組明顯減少。
　　 7、轉(zhuǎn)染miR-345的LNCaP細(xì)胞去雄培養(yǎng)3天后出現(xiàn)明顯神經(jīng)內(nèi)分泌樣改變，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞NSE表達(dá)水平也在去雄培養(yǎng)3天后較對(duì)照組明顯升高。
　　 8、RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞PSA、AR表達(dá)結(jié)果示：轉(zhuǎn)染m

12、iR-345的LNCaP細(xì)胞AR表達(dá)無明顯變化，但DHT誘導(dǎo)的PSA表達(dá)較對(duì)照組明顯減少；而轉(zhuǎn)染anti-miR-345的LNCaP-AI細(xì)胞的AR表達(dá)無明顯變化，但DHT誘導(dǎo)的PSA表達(dá)較對(duì)照組明顯增加。
　　 9、通過生物信息學(xué)方法篩選及RT-PCR、WesternBlot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-345通過調(diào)控CDC25B而影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期。
　　 10、收集ADPC及AIPC患者術(shù)前全血，利用RT-PCR法檢測(cè)前列腺癌患

13、者血清miR-345表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在AIPC患者中明顯增高，且與血清PSA相關(guān)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、通過基因芯片和細(xì)胞模型篩選出明顯差異表達(dá)miRNA7個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)5個(gè)：miR-345、miR-221、miR-663、miR-222、miR-106a，表達(dá)下調(diào)2個(gè)：miR-29c、miR-148a。
　　 2、miR-345在人AIPC組織和ADPC組織中差異表達(dá)顯著，而且miR-345在LNCaP-

14、AI細(xì)胞系中的含量明顯高于LNCaP、PC3、C42、RWPE-1細(xì)胞系，提示miR-345可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其在前列腺癌的惡性進(jìn)展、激素非依賴性轉(zhuǎn)化進(jìn)程中發(fā)揮作用。
　　 3、CCK-8及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：miR-345能明顯促進(jìn)LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并增強(qiáng)LNCaP細(xì)胞的遷移能力；而且流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-345能明顯增加前列腺癌S期細(xì)胞。說明miR-345在前列腺癌惡性進(jìn)展中起一定促進(jìn)

15、作用。
　　 4、RT-PCR法檢測(cè)NSE、PSA以及AR結(jié)果示：miR-345能明顯促進(jìn)LNCaP細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌樣改變；不影響LNCaP和LNCaP-AI細(xì)胞AR受體的表達(dá)，但明顯影響AR介導(dǎo)的PSA表達(dá)，降低LNCaP細(xì)胞的雄激素敏感性。提示miR-345參與前列腺癌激素非依賴性轉(zhuǎn)化。
　　 5、通過生物信息學(xué)方法篩選及RT-PCR、WesternBlot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-345通過調(diào)控CDC25B而影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期