LSD1在前列腺癌雄激素非依賴性表型轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文分兩個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：過表達(dá)和干擾LSD1的慢病毒載體構(gòu)建和鑒定
　　目的：構(gòu)建和鑒定過表達(dá)和干擾LSD1慢病毒載體，為進(jìn)一步的實驗研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.采用PCR技術(shù)從LSD1 cDNA克隆質(zhì)粒中釣取LSD1基因，并將該基因克隆到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒GV166中，構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒GV166-LSD1，通過PCR鑒定、測序比對目的基因LSD1，用GV166-LSD1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后Wes

2、tern Blot檢測LSD1蛋白的表達(dá)，將GV166-LSD1質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝和生產(chǎn)攜帶LSD1基因的重組慢病毒LV-LSD1，測定病毒滴度。LV-LSD1感染LNCaP細(xì)胞后，Real-time定量PCR和Western Blot檢測LSD1基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。2.LV-LSD1-感染LNCaP細(xì)胞后，通過puromycin抗性壓力篩選過表達(dá)LSD1的單克隆穩(wěn)

3、定株LNCaP-LSD1細(xì)胞，定量PCR和Western Blot檢測LNCaP-LSD1細(xì)胞LSD1基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。3.根據(jù)權(quán)威文獻(xiàn)驗證過的LSD1基因siRNA干擾靶點序列，構(gòu)建shRNA慢病毒（Lentivirus,LV）表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR鑒定和測序比對，將GV307-LSD1-shRNA質(zhì)粒載體及包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝成LV-LSD1-shRNA，并進(jìn)

4、行滴度測定；LV-LSD1-shRNA感染LNCaP-AI細(xì)胞后，Real-time定量PCR和Western Blot檢測LSD1基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建過表達(dá)LSD1慢病毒載體LV-LSD1，病毒滴度為2.0E+8 TU/ml，LV-LSD1感染LNCaP細(xì)胞后，其LSD1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高。2.篩選出過表達(dá)LSD1的單克隆穩(wěn)定株LNCaP-LSD1細(xì)胞，其LSD1 mRNA和蛋白

5、的表達(dá)水平升高。3.構(gòu)建出干擾LSD1表達(dá)慢病毒載體LV-LSD1-shRNA，病毒滴度為5.0E+7 TU/ml，LV-LSD1-shRNA感染LNCaP-AI細(xì)胞后，其LSD1 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建過表達(dá)LSD1慢病毒載體LV-LSD1；成功篩選獲得過表達(dá)LSD1的單克隆穩(wěn)定株LNCaP-LSD1細(xì)胞，并在mRNA和蛋白表達(dá)水平驗證了LSD1過表達(dá)；成功構(gòu)建干擾 LSD1的慢病毒載體LV-LSD1

6、-shRNA，并在LNCaP-AI細(xì)胞產(chǎn)生了預(yù)期的干擾效應(yīng)。上述成果為進(jìn)一步研究LSD1在前列腺癌雄激素非依賴性表型轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。
　　第二部分：LSD1在前列腺癌雄激素非依賴性表型轉(zhuǎn)化中的作用及可能機(jī)制
　　目的：探討LSD1在前列腺癌雄激素非依賴性表型轉(zhuǎn)化中的作用及可能機(jī)制。
　　方法：1.CCK-8法檢測LNCaP-LSD1與LNCaP細(xì)胞在Bicalutamide處理后細(xì)胞增殖水平的差異，以及

7、LSD1-siRNA、con-siRNA、Pargyline、Tranylcypromine處理后LNCaP和LNCaP-AI細(xì)胞的細(xì)胞活力的變化，以及以上處理聯(lián)合R1881刺激后細(xì)胞數(shù)量的改變。2.定量PCR和Western blot檢測LNCaP細(xì)胞和LNCaP-LSD1細(xì)胞AR mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異；ELISA法檢測LNCaP細(xì)胞與LNCaP-LSD1細(xì)胞在不同濃度Bicalutamide處理后PSA分泌水平的差異，并檢測

8、LSD1-siRNA、con-siRNA單獨或與Bicalutamide聯(lián)合處理后LNCaP-AI細(xì)胞PSA分泌水平的變化。3.FCM亞G1峰(sub G1)法檢測Etoposide單獨或與LSD1-siRNA、con-siRNA聯(lián)合處理后LNCaP-AI細(xì)胞凋亡的差異；定量PCR和Western Blot檢測LNCaP和LNCaP-LSD1細(xì)胞p53、p21和Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，觀察LSD1-siRNA處理后LNCa

9、P-AI細(xì)胞p21和HDM2 mRNA和蛋白的變化；Western Blot檢測Con-siRNA和LSD1-siRNA處理后LNCaP-AI細(xì)胞的Bax、PUMA和survivin蛋白表達(dá)水平的差異。
　　結(jié)果：1.LNCaP細(xì)胞在在去雄激素環(huán)境或 Bicalutamide阻斷雄激素受體后增殖能力受到明顯抑制，而LNCaP-LSD1細(xì)胞仍能持續(xù)增殖；LSD1-siRNA、Pargyline和Tranylcypromine處理后，

10、LNCaP和LNCaP-AI細(xì)胞活力均明顯降低；此外，LSD1-siRNA和Tranylcypromine抑制了R1881對LNCaP和LNCaP-AI細(xì)胞的促增殖效應(yīng)。2.LNCaP細(xì)胞和LNCaP-LSD1細(xì)胞AR mRNA和蛋白表達(dá)水平的無明顯差異；LNCaP-LSD1細(xì)胞PSA分泌水平顯著高于LNCaP細(xì)胞，10μmol/L Bicalutamide顯著降低LNCaP細(xì)胞PSA分泌水平，但對LNCaP-LSD1細(xì)胞PSA分泌水平

11、無影響；Bicalutamide對LNCaP-AI細(xì)胞PSA分泌無影響，LSD1-siRNA處理使Bicalutamide重新獲得了對LNCaP-AI細(xì)胞PSA分泌的抑制效應(yīng)。3.LSD1-siRNA促進(jìn)了Etoposide誘導(dǎo)的LNCaP-AI細(xì)胞凋亡，LNCaP-LSD1細(xì)胞p53 mRNA和蛋白表達(dá)量與 LNCaP細(xì)胞無明顯差別，p21、Bax mRNA和蛋白表達(dá)量較LNCaP細(xì)胞明顯減少；LSD1-siRNA增加了LNCaP-A