SNAP29在人類成熟中性粒細(xì)胞的表達(dá)、亞細(xì)胞定位與功能研究.pdf

1、背景與目的： 本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究可能存在于人類PMN的其他SNARE蛋白及其亞細(xì)胞分布，首次發(fā)現(xiàn)SNAP29表達(dá)于人類PMN，并分布于中性粒細(xì)胞TG與SG膜。至于VAMP1，VAMP2與syntaxin4，因其與SNAP29組成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)PMN胞裂外排，故再次驗(yàn)證其在PMN的表達(dá)與亞細(xì)胞分布。過去的研究還發(fā)現(xiàn)，某些SNARE蛋白的編碼基因在PMN表達(dá)A，B兩種亞型，本實(shí)驗(yàn)合成新的引物，擴(kuò)增長片段基因與過去未測序的基因片段

2、，并克隆與測序，研究VAMP1，VAMP2與syntaxin4是否表達(dá)亞型。 方法： (1)采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)，研究SNAP29蛋白在PMN內(nèi)的表達(dá)。 (2)采用基因克隆與測序，研究SNAP29基因在PMN內(nèi)的表達(dá)。 (3)用人髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞做研究模型，研究SNAP29蛋白/基因表達(dá)于HL60細(xì)胞。 半定量RT-PCR研究HL60細(xì)胞向PMN分化過程中，SNAP29mRNA表達(dá)水平的變

3、化。 上述實(shí)驗(yàn)為SNAP29蛋白/基因表達(dá)于PMN進(jìn)一步提供佐證。 (4)PMN去核總蛋白、膜蛋白與胞質(zhì)溶膠，用免疫印跡分析法研究SNAP29是否為膜結(jié)合蛋白。 (5)蔗糖密度梯度離心分離PMN各亞細(xì)胞器，分析各亞細(xì)胞部分特異性標(biāo)記物活性與溶菌酶活性。各亞細(xì)胞部分進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，研究SNAP29蛋白在靜息PMN的亞細(xì)胞分布。 (6)15-nm金標(biāo)的抗胞漿顆粒標(biāo)記物抗體標(biāo)記不同胞漿顆粒，10-nm金標(biāo)的抗

4、SNAP29抗體標(biāo)記SNAP29陽性顆粒，結(jié)合免疫電鏡檢測術(shù)，分析SNAP29與各胞漿顆粒標(biāo)記物共存于同一顆粒，進(jìn)一步研究SNAP29蛋白在靜息PMN的亞細(xì)胞分布。 結(jié)果： (1)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，SNAP29蛋白表達(dá)于人PMN。 (2)基因克隆與測序表明，SNAP29基因表達(dá)于人PMN。 Syntaxin4 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，顯示兩條電泳帶，分別為1278與1414 bp，基因測序表明，下帶

5、堿基序列與Genbank收錄的syntaxin4基因序列完全一致，而上帶為下帶堿基序列中插入136個(gè)核苷酸的內(nèi)含子。 (3)SNAP29蛋白/基因表達(dá)于HL60細(xì)胞。半定量RT-PCR研究顯示，在HL60細(xì)胞向PMN分化過程中，SNAP29mRNA表達(dá)水平上調(diào)，并于DMSO誘導(dǎo)分化4天后，其表達(dá)水平近似于PMN的表達(dá)水平.進(jìn)一步證實(shí)了SNAP29蛋白/基因表達(dá)于PMN，并提示SNAP29蛋白可能是PMN發(fā)揮某些生理功能的必需蛋白

6、。 (4)SNAP29為膜結(jié)合蛋白。 (5)①各亞細(xì)胞部分特異性標(biāo)記物活性測定結(jié)果顯示，第1部分含胞質(zhì)溶漿；第2、3部分含胞漿膜；第4、5部分含TG；第5、6部分含SG；第7、8部分含AG。 ②溶菌酶活性測定結(jié)果顯示，溶菌酶主要位于靜息PMN第4、5、6、7、8亞細(xì)胞部分，即TG、SG與AG。但PMN經(jīng)PMA活化后，第4、5、6部分溶菌酶活性顯著降低，第8部分溶菌酶仍然最高。表明PMA動(dòng)員TG與SG轉(zhuǎn)位至胞漿膜，

7、但較少動(dòng)員AG轉(zhuǎn)位。 ⑧免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靜息PMN，SNAP29位于第4，5，6部分，即TG與SG膜。VAMP1位于第4，5，6，7，8部分，即TG、SG與AG膜；VAMP2位于第4，5，6部分，即TG與SG膜；syntaxin4位于第2，3部分，即胞漿膜。 在PMA活化的PMN，SNAP29從第4，5，6部分轉(zhuǎn)位至第2，3部分，即胞漿膜；位于第4，5，6部分的VAMP1轉(zhuǎn)位至胞漿膜，而位于第7，8部分的VAMP

8、1不發(fā)生轉(zhuǎn)位；VAMP2從第4，5，6部分轉(zhuǎn)位至胞漿膜；syntaxin4仍位于第2，3部分，即胞漿膜。 (6)膠體金雙標(biāo)胞漿顆粒結(jié)合免疫電鏡檢測結(jié)果表明，SNAP29位于TG與SG膜。VAMP1位于TG、SG與AG膜；VAMP2位于TG與SG膜；syntaxin4位于胞漿膜。 結(jié)論： (1)SNAP29(VAMP1，VAMP2與syntaxin4)蛋白表達(dá)于人PNN。 (2)SNAP29(VAMP1，V

9、AMP2與syntaxin4)基因表達(dá)于人PMN。 (3)SNAP29位于靜息中性粒細(xì)胞TG與SG膜。VAMP1位于TG、SG與AG膜；VAMP2位于TG與SG膜；syntaxin4位于胞漿膜。 背景與目的： 人類中性粒細(xì)胞含三級(jí)顆粒、特異性顆粒、嗜苯胺藍(lán)顆粒與分泌囊泡，不同顆粒被動(dòng)員的難易程度存在顯著差異，其中TG與SG易于動(dòng)員，一旦PMN活化即發(fā)生胞裂外排，調(diào)節(jié)PMN的粘附、滲出與殺微生物效應(yīng)；AG最不易被

10、動(dòng)員，其胞裂外排常發(fā)生于對(duì)吞噬小體的處理過程中。PMN不同胞漿顆粒被動(dòng)員的難易程度不同，提示機(jī)體存在某種機(jī)制，對(duì)PMN不同顆粒的分泌進(jìn)行精確調(diào)控。 方法： (1)制備電通透的PMN，孵育不同劑量的抗SNAP29抗體，然后用Ca2++GTP-γ-S活化電通透的PMN，多聚甲醛固定，用抗CD66b或抗CD63的抗體孵育細(xì)胞，再孵育FITC偶聯(lián)的熒光二抗，流式細(xì)胞術(shù)檢測抗SNAP29抗體對(duì)細(xì)胞活化引起的細(xì)胞表面CD66b或CD

11、63上調(diào)的抑制效應(yīng)，研究SNAP29是否調(diào)節(jié)TG、SG與AG分泌。 (2)聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP29與其他抗體孵育電通透的PMN，研究兩種抗體對(duì)細(xì)胞活化引起的細(xì)胞表面CD66b或CD63上調(diào)的協(xié)同抑制效應(yīng)，并推斷SNAP29在調(diào)節(jié)胞漿顆粒分泌過程中可能形成的SNARE復(fù)合體。 (3)免疫共沉淀研究PMN胞漿顆粒分泌過程中可能形成的SNARE復(fù)合體。經(jīng)PMA活化的PMN制備蛋白溶漿，用預(yù)先結(jié)合有抗SNAP29抗體的protei

12、n A-Sepharose免疫沉淀PMN活化過程中可能形成的含SNAP29的SNARE復(fù)合體。免疫沉淀物用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)，用抗VAMP1，抗VAMP2或抗syntaxin4等抗體探測SNAP29的同源SNARE蛋白。 結(jié)果： (1)抗SNAP29與抗VAMP2均劑量依賴性抑制PMN活化引起的細(xì)胞表面CD66b上調(diào)，但兩者均不抑制CD63上調(diào)，表明SNAP29與VAMP2均調(diào)節(jié)TG與SG分泌，但均不調(diào)節(jié)AG分泌。

13、(2)聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP29與抗VAMP1，協(xié)同抑制CD66b上調(diào)，但對(duì)CD63上調(diào)的抑制效應(yīng)，與單用VAMP1相同，表明SNAP29可能與TG及SG上的VAMP1形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)TG與SG分泌，但AG的分泌受VAMP1調(diào)節(jié)，而不受SNAP29調(diào)節(jié)。 聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP29與抗VAMP2，協(xié)同抑制CD66b上調(diào)，但不抑制CD63上調(diào)，表明SNAP29與VAMP2可能形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)TG與SG分泌，但兩者均不調(diào)

14、節(jié)AG分泌。 聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP29與抗syntaxin4，協(xié)同抑制CD66b上調(diào)，但對(duì)CD63上調(diào)的抑制效應(yīng)，與單用syntaxin4相同，表明SNAP29與syntaxin4可能形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)TG與SG分泌，但AG的分泌受syntaxin4調(diào)節(jié)，而不受SNAP29調(diào)節(jié)。 (3)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PMA活化的PMN蛋白溶漿，抗SNAP29抗體能免疫沉淀VAMP1，VAMP2與syntaxin4，表明S

15、NAP29能與VAMP1，VAMP2和syntaxin4中任一蛋白形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)TG與SG胞裂外排。 抗VAMP2抗體能免疫沉淀SNAP29與syntaxin4，但不能免疫沉淀VAMP1，表明VAMP2能與SNAP29和syntaxin4中任一蛋白形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)TG與SG胞裂外排，但VAMP2與VAMP1不形成SNARE復(fù)合體。 抗syntaxin4抗體能免疫沉淀SNAP29，VAMP1與VAMP

16、2，表明syntaxin4能與SNAP29，VAMP1和VAMP2中任一蛋白形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)TG與SG胞裂外排。 fMLP活化的PMN蛋白溶漿，抗syntaxin4抗體能免疫沉淀SNAP29，VAMP1與VAMP2，且沉淀VAMP1的量，顯著多于PMA活化的PMN蛋白溶漿中沉淀的VAMP1的量，表明syntaxin4不僅與TG及SG上的VAMP1形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)TG與SG分泌，而且與AG上的VAMP1形成S

17、NARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)AG分泌。 綜合免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SNAP29可能形成兩個(gè)SNARE復(fù)合體，即：SNAP29/VAMP1/syntaxin4與SNAP29/VAMP2/syntaxin4，調(diào)節(jié)TG與SG分泌。VAMP1與syntaxin4亦可能形成SNARE復(fù)合體，調(diào)節(jié)AG分泌。VAMP1與VAMP2不共存于同一個(gè)SNARE復(fù)合體。 結(jié)論： (1)SNAP29，VAMP1，VAMP2與syntaxin4皆調(diào)