人補(bǔ)體受體1型衍生分子融合蛋白CR1-SCR2D的構(gòu)建及對小鼠膿毒癥炎癥損傷的保護(hù)作用.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),是住院危重患者的主要死亡原因之一。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,涉及到各個系統(tǒng)的共同作用。其始動環(huán)節(jié)之一,是補(bǔ)體系統(tǒng)識別病原微生物發(fā)生過度活化。病原菌的菌體成分、內(nèi)毒素、外毒素等使得補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活,產(chǎn)生大量的炎癥效應(yīng)片段,造成后續(xù)級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)。目前抑制補(bǔ)體的過度活化已成為防治膿毒癥炎癥

2、損傷的重要策略之一。
　　在經(jīng)典、旁路、凝集素三條通路中,補(bǔ)體激活的起始位點(diǎn)不同,但都形成 C3轉(zhuǎn)化酶,在C3處匯合,進(jìn)而形成C5轉(zhuǎn)化酶,共同進(jìn)入終末途徑。如果能在C3處防止C3/C5轉(zhuǎn)化酶的形成,可減少炎癥效應(yīng)片段如C3a、C5a、C5b-9等的釋放,在一定程度上就能夠防止或減輕SIRS的發(fā)生與發(fā)展。
　　我室曾研制了人補(bǔ)體受體1型(complement receptor type1,CR1)的兩個活性片段短同源重復(fù)序列(

3、short consensus repeats,SCR)1-3和SCR15-17,分別用畢赤酵母進(jìn)行表達(dá),證明其具有體外抑制補(bǔ)體的生物活性作用和體內(nèi)抗炎保護(hù)作用。這兩個片段分別結(jié)合C4b和C3b,只能抑制一條或兩條補(bǔ)體激活通路,保護(hù)作用有限。因此,本研究構(gòu)建了能結(jié)合C4b、C3b的雙功能域CR1衍生分子(complement receptor type1-short consensus repeats of two domains, C

4、R1-SCR2D),檢測融合蛋白在體外抑制補(bǔ)體的生物活性,并進(jìn)行了小鼠膿毒癥損傷的保護(hù)性研究。本研究主要獲得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D的構(gòu)建。將畢赤酵母質(zhì)粒pPIC9k原有的多克隆位點(diǎn)替換為新的多克隆位點(diǎn) pPIC9k(+);用我室前期構(gòu)建的 pPIC9k-SCR1-3和pPIC9k-SCR15-17作模板,PCR擴(kuò)增基因 SCR1-3和 SCR15-17,依次克隆連接到pPIC9k(+)上,在二

5、者中間加入 linker序列,構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒pPIC9k(+)-SCR2D;最后將目的基因SCR2D克隆到載體pPICZαB上,得到表達(dá)載體pPICZαB-SCR2D。雙酶切和測序鑒定表明,表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D構(gòu)建成功。
　　2.表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαB-SCR2D電轉(zhuǎn)化畢赤酵母后進(jìn)行表達(dá)及鑒定。表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB-SCR2D經(jīng)過Sac I單酶切后電轉(zhuǎn)畢赤酵母X-33感受態(tài),從博來霉素(Zeocin)

6、的 YPD平板上挑取單克隆,行 PCR鑒定陽性重組子。確立目的蛋白在重組酵母X-33/CR1-SCR2D中有分泌表達(dá)。采用小鼠抗人CR1抗體經(jīng)Western blot鑒定,在分子量約90kDa處出現(xiàn)陽性條帶。
　　3.目的蛋白CR1-SCR2D經(jīng)Ni-NTA柱純化及糖基化鑒定。表達(dá)上清過Ni-NTA柱后,低濃度咪唑洗脫雜蛋白,高濃度咪唑洗脫目的蛋白。SDS-PAGE電泳顯示,在分子量約90kDa處有彌散條帶,目的蛋白純度較高。目的

7、蛋白經(jīng)29kDa的Endo H糖苷酶處理后,分子量達(dá)到理論大小的45kDa,帶型也變規(guī)則,證明 CR1-SCR2D存在糖基化。
　　4.目的蛋白CR1-SCR2D的體外抑制補(bǔ)體生物活性鑒定。用CH50和AH50對目的蛋白 CR1-SCR2D進(jìn)行經(jīng)典途徑和旁路途徑抑制補(bǔ)體活性檢測,結(jié)果顯示CR1-SCR2D均可抑制兩條通路的激活,并且抑制補(bǔ)體活性分別高于 SCR1-3和SCR15-17。去糖基化后的CR1-SCR2D對CH50和AH

8、50溶血活性沒有影響。另外證明CR1-SCR2D對旁路和MBL途徑激活片段C4b、C3b在酵母多糖上沉積有抑制作用。
　　5.目的蛋白CR1-SCR2D對膿毒癥小鼠炎癥損傷的保護(hù)性效應(yīng)。用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(CLP)成功構(gòu)建小鼠的膿毒癥模型。進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明CR1-SCR2D在一定程度上能保護(hù)小鼠96h的生存率。CR1-SCR2D可以降低膿毒癥小鼠24h后血清C5a、IL-6和TNF-α的水平,降低膿毒癥小鼠肺臟的MPO水平,降

9、低膿毒癥小鼠血液的細(xì)菌水平。免疫組化結(jié)果表明,CR1-SCR2D使膿毒癥小鼠C4b、C3b在肺臟上的沉積減少。小鼠肺臟病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,CR1-SCR2D明顯減輕了肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)出血、水腫、炎細(xì)胞浸潤、局部實(shí)變的病理損傷。
　　綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαB-SCR2D,實(shí)現(xiàn)了目的蛋白 CR1-SCR2D在畢赤酵母中的分泌表達(dá),經(jīng)過純化獲得了目的蛋白。體外生物活性結(jié)果證明,目的蛋白 CR1-SCR2