小麥Na+-H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaNHX2的功能驗(yàn)證及功能域分析.pdf

1、土壤鹽漬化是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一,其中Na+是土壤鹽分的主要成份,而且由于不合理灌溉引起的次生鹽漬化使鹽漬化土壤的面積繼續(xù)增加。據(jù)統(tǒng)計(jì),影響作物產(chǎn)量的各種環(huán)境因素中,干旱和鹽堿造成的減產(chǎn)在40％以上,因此,如何提高植物的耐鹽性成為當(dāng)前一個(gè)迫切需要解決的科學(xué)問題。研究表明植物耐鹽的關(guān)鍵是維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的低鹽濃度,鹽脅迫下Na+會(huì)通過非特異性離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),為了減輕Na+的危害,植物主要通過兩種方式來降低細(xì)胞質(zhì)中鹽的濃度:一種是通

2、過質(zhì)膜上的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Na+排出體外,另一種方式是通過液泡膜上的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Na+區(qū)隔化到液泡中,從而維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡。小麥屬淡土植物,其生長受到鹽脅迫的抑制,鹽害直接影響著小麥生產(chǎn)的發(fā)展。本研究借助酵母(Saccharomyces cerevisiae)突變體,對(duì)小麥Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaNHX2的功能及其C-末端功能域進(jìn)行了分析,主要結(jié)果如下:
　　 1.生物信息學(xué)分析表明,小麥Na+/H+逆

3、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaNHX2與植物NHX蛋白中ClassⅠ類的液泡膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX1,AtNHX2,OsNHX2的同源性較高,分別為70.17％,71.95％,71.04％,而與ClassⅡ類的核內(nèi)體Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LeNHX2同源性較低,僅為26.87％。但是GFP定位結(jié)果表明,TaNHX2的位置與LeNHX2的位置相似,位于前液泡區(qū)。
　　 2.構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-TaNHX2,用PEG/LiAc熱擊

4、轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入酵母中,通過酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了TaNHX2基因可以部分恢復(fù)酵母鹽敏感突變體AXT3K的耐鹽功能,可在Ap+50 mM NaCl和Ap+0.5 M KCl的培養(yǎng)基中生長,而轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照則表現(xiàn)為致死。說明TaNHX2不僅有轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的功能,同時(shí)也有轉(zhuǎn)運(yùn)K+的功能。通過對(duì)20 mM NaCl條件下酵母細(xì)胞中的Na+、K+離子含量測定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)TaNHX2基因的酵母細(xì)胞中Na+的含量與對(duì)照相比沒有顯著差異,而K+含量差異達(dá)到了顯

5、著水平,這可能是由于TaNHX2的耐鹽性不單是其轉(zhuǎn)運(yùn)Na+,更重要的是由于K+在細(xì)胞內(nèi)的積累而導(dǎo)致耐鹽性增強(qiáng)。
　　 3.用熒光定量PCR的方法研究了TaNHX2基因在NaCl鹽脅迫、4℃低溫脅迫、ABA離子脅迫和PEG6000干旱脅迫這4種不同逆境條件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明,在沒有脅迫時(shí),TaNHX2基因在根和葉片中都表達(dá),說明小麥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNHX2具有維持植物體內(nèi)離子平衡的功能。在NaCl鹽脅迫和ABA

6、離子脅迫下,根中的表達(dá)量比較大,而在葉中TaNHX2幾乎不表達(dá),在低溫和干旱脅迫下,葉中的表達(dá)量要高于根中的表達(dá)量,說明TaNHX2基因的表達(dá)具有組織特異性。TaNHX2基因在植物受到非生物脅迫或ABA脅迫時(shí)起到非常關(guān)鍵的作用,因此可以推測小麥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNHX2在維持細(xì)胞的滲透壓平衡方面同樣具有重要的作用。
　　 4.為了研究TaNHX2 C-末端的作用,采用PCR的方法獲得了一系列包含不同C-末端的TaN

7、HX2突變體,通過酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了部分TaNHX2突變體基因的功能與野生型在耐鹽方面存在差異。其中轉(zhuǎn)突變體基因Δ439aa的酵母可在Ap+80mM NaCl的培養(yǎng)基中生長,而全長基因TaNHX2則只能在Ap+50mM NaCl的培養(yǎng)基中生長,在Licl脅迫條件下,轉(zhuǎn)突變體基因Δ439aa的酵母在0.5mM LiCl條件下不能生長,而其它突變體和野生型可在0.8mMLiCl條件下正常生長。在40 mM NaCl條件下,通過對(duì)OD60