SM22αC端功能域的重組表達及功能研究.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型轉(zhuǎn)化是動脈粥樣硬化、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病的共同病理生理過程。其中，VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中表型標(biāo)志基因的表達變化和細(xì)胞骨架的重構(gòu)是當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點問題之一。平滑肌22α(SM22α)是近年發(fā)現(xiàn)的一種VSMC分化標(biāo)志物，其表達具有平滑肌組織特異性和細(xì)胞表型特異性，該蛋白的確切功能尚不清楚，推測與細(xì)胞骨架聚合有關(guān)。為了確定SM22α是否與細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白(actin)存在相互作用

2、以及二者之間的結(jié)合在VSMC骨架重構(gòu)和表型轉(zhuǎn)化過程中的病理生理學(xué)意義，本研究通過重組表達GST-SM22α融合蛋白，制備兔抗SM22α多克隆抗體，用其觀察該蛋白在不同表型VSMC中的細(xì)胞定位及其與骨架聚合和細(xì)胞收縮之間的關(guān)系。 1SM22αC端功能域在大腸桿菌中的高效表達及抗體制備構(gòu)建含SM22αC端功能域(72～201位氨基酸)和GST編碼序列的原核表達質(zhì)粒，誘導(dǎo)E.coli高效表達可溶性GST-SM22α融合蛋白，分離、純化

3、融合蛋白，制備兔抗SM22α多克隆抗體。結(jié)果如下： 1.1pGEX3X-SM22α的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建GST-SM22α融合蛋白表達質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增和BamHI/EcoRI雙酶切鑒定后，命名為pGEX3X-SM22α。 1.2GST-SM22α融合蛋白的誘導(dǎo)表達pGEX3X-SM22α宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達預(yù)期分子量的GST-SM22α融合蛋白，該融合蛋白以胞漿可溶性蛋白和包含體兩種形式存在。在培養(yǎng)物(OD6

4、00=1.5)按1∶50接種于含0.5mmol/LIPTG的LB培養(yǎng)液中，30℃誘導(dǎo)6h的條件下，SM22α蛋白以胞漿可溶性形式存在的比例最高，是GST-SM22α蛋白誘導(dǎo)表達的最佳條件。 1.3GST-SM22α融合蛋白的分離純化和抗體制備細(xì)菌裂解液上清直接經(jīng)GST親和層析進行純化后，每100ml培養(yǎng)物可得到約20mg電泳純的可溶性GST-SM22α融合蛋白。包含體經(jīng)洗滌、純化、溶解后，GST-SM22α融合蛋白純度可達95％

5、，以此為抗原常規(guī)免疫新西蘭白兔，制備兔抗SM22α多克隆抗體，對流免疫電泳測定抗體效價為1∶16。Westernblot證實該抗體具有較高的特異性。 2SM22α在VSMC細(xì)胞骨架重構(gòu)中的作用應(yīng)用蛋白分步提取及Westernblot檢測F-actin/G-actin中SM22α的含量變化，GSTpulldown分析、F-actin體外聚合實驗和免疫共沉淀檢測SM22α與actin的相互作用，免疫熒光染色觀察SM22α和actin

6、在VSMC中的定位關(guān)系。建立不同代數(shù)、密度VSMC去分化/再分化模型，觀察收縮蛋白的表達和定位與VSMC骨架重構(gòu)及收縮能力之間的關(guān)系。結(jié)果如下： 2.1SM22α的亞細(xì)胞定位與actin一致應(yīng)用免疫雙熒光染色分別標(biāo)記SM22α與F-actin，熒光顯微鏡下觀察二者在VSMC中的分布。血清饑餓72h后，actin聚合成粗大的纖維束，沿VSMC長軸分布，SM22α在細(xì)胞中的分布與α-actin具有一致關(guān)系，提示SM22α可能通過與a

7、ctin相互作用而參與VSMC細(xì)胞骨架的聚合。 2.2SM22α參與F-actin聚合通過血清饑餓/刺激建立VSMC再分化/去分化模型，蛋白分步提取和Westernblot檢測SM22α和actin在細(xì)胞中的分布。結(jié)果顯示，血清饑餓培養(yǎng)的VSMC中，F(xiàn)-actin/G-actin比值略有增加，SM22α在F-actin中的分布比例也呈上升趨勢，與F-actin變化具有平行關(guān)系；同樣，恢復(fù)血清刺激后，由于F-actin的解聚，該組

8、分中SM22α含量也明顯減少，提示VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中紐胞內(nèi)的SM22α參與細(xì)胞骨架F-actin的聚合過程。 2.3SM22α與actin相互作用參與細(xì)胞骨架重構(gòu)為了確定參與細(xì)胞骨架聚合的SM22α是否與actin發(fā)生物理學(xué)上的相互作用，以結(jié)合有SM22αC端功能域的GSTSepharose4B為親和介質(zhì)對VSMCF-actin組分蛋白進行淘選，Westernblot分析表明，從親和介質(zhì)結(jié)合物中可以檢測到actin的存在，而

9、且在收縮型VSMC中親和得到的actin明顯多于合成型VSMC，這與收縮型VSMC中F-actin比例增加具有相關(guān)關(guān)系。為了明確SM22αC端功能域是否具有促進F-actin體外交聯(lián)的作用，將GST-SM22α蛋白純品與F-actin共孵育，SDS-PAGE和電鏡觀察均可檢測到沉淀中交聯(lián)的F-actin，表明SM22α可通過C端功能域促進F-actin發(fā)生體外交聯(lián)。為了進一步探明內(nèi)源性SM22α是否與actin結(jié)合，以抗SMα-acti

10、n抗體進行免疫沉淀，得到的蛋白A-抗原-抗體三元復(fù)合物中可以檢測到SM22α的存在，且隨著血清饑餓時間的延長，結(jié)合在actin上的SM22α明顯增多。以上結(jié)果表明，SM22α通過與F-actin結(jié)合參與VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞骨架的重構(gòu)。 2.4細(xì)胞代數(shù)影響VSMC骨架重構(gòu)和SM22α分布我們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞傳代次數(shù)和密度不同的條件下，收縮型VSMC的收縮反應(yīng)性存在差異。為了進一步明確細(xì)胞代數(shù)、密度與VSMC的收縮反應(yīng)

11、性之間的關(guān)系及其內(nèi)在機制，分別將生長至不同密度(30％～50％匯合或超匯合)的3代和8代細(xì)胞進行血清饑餓，以收縮反應(yīng)性及細(xì)胞骨架微絲聚合為指標(biāo)觀察VSMC再分化情況。蛋白分步提取和Westernblot檢測F-actin組分/G-actin組分中收縮蛋白含量的變化，分析不同代數(shù)、密度的細(xì)胞收縮反應(yīng)性及其與F-actin聚合和交聯(lián)的特征，探討SM22α在不同actin組分中的分布與細(xì)胞骨架重構(gòu)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清饑餓誘導(dǎo)后，低代數(shù)(3代

12、)、高密度(超匯合)的VSMC微絲排列呈極性、粗大、束狀平行的應(yīng)力纖維，興奮劑誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮明顯增強。蛋白分布提取和Westernblot分析表明，血清饑餓處理可明顯誘導(dǎo)actin聚合為F-actin，并伴有SM22α在F-actin中的富集，該效應(yīng)與細(xì)胞的收縮反應(yīng)性有一致關(guān)系，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，該效應(yīng)逐漸減弱；而收縮蛋白SM1-MHC和SM2-MHC在不同actin組分中的分布可能與細(xì)胞密度有關(guān)。 結(jié)論1.成功構(gòu)建了GS

13、T-SM22α融合蛋白大腸桿菌表達系統(tǒng)，獲得電泳純的GST-SM22α融合蛋白，制備了兔抗SM22α多克隆抗體。 2.證實含SM22αCH-C端和CLR結(jié)構(gòu)域肽段具有與F-actin結(jié)合和促F-actin交聯(lián)的活性，SM22α可通過CH-C端和CLR結(jié)構(gòu)域肽段與actin相互作用而參與VSMC細(xì)胞骨架重構(gòu)。 3.細(xì)胞傳代次數(shù)和生長密度通過改變不同收縮蛋白的比例而影響VSMC細(xì)胞骨架重構(gòu)，SM22α通過促進F-actin聚