ZEB2在肝癌血管生成擬態(tài)形成中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一種常見(jiàn)原發(fā)性惡性腫瘤,具有高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率。盡管近年來(lái)肝癌的治療手段有了明顯進(jìn)展,但治療效果仍不盡如人意，患者的生存質(zhì)量、存活時(shí)間都沒(méi)有顯著改善。不同于傳統(tǒng)的腫瘤血供模式，血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是一種獨(dú)特的腫瘤微循環(huán)模式，并且往往關(guān)聯(lián)著腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后。在 VM形成的分子機(jī)制中，有較

2、多的觀點(diǎn)支持上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與其中，但兩者之間的調(diào)控機(jī)制仍不明確。本研究旨在通過(guò)分析EMT轉(zhuǎn)錄因子ZEB2在人肝癌中表達(dá)和預(yù)后價(jià)值，初步揭示ZEB2與VM的關(guān)系；通過(guò)研究細(xì)胞因子TGF-β1對(duì)體外肝癌細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步證實(shí)EMT參與肝癌VM形成；通過(guò)研究ZEB2對(duì)細(xì)胞功能的影響，探討ZEB2調(diào)控的EMT在肝癌血管生成擬態(tài)形成中的可能作用機(jī)制。
　　

3、方法：
　　1）通過(guò)特殊染色方法—CD31/PAS雙重染色方法標(biāo)記肝癌組織中VM管道結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)人肝癌組織中ZEB2的表達(dá)并分析ZEB2與VM形成、臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及預(yù)后價(jià)值。
　　2）選取不能形成管道樣結(jié)構(gòu)的肝癌HepG2細(xì)胞系，用細(xì)胞因子TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)和成管能力的變化。
　　3）Western blot檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的肝癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Sn

4、ail、Slug和ZEB2的表達(dá)情況；檢測(cè)EMT相關(guān)分子E-cadherin，Vimentin及內(nèi)皮相關(guān)分子VE-cadherin的表達(dá)情況。
　　4）Western blot檢測(cè)四種肝癌細(xì)胞系HepG2，Bel7402，PLC和SMMC7221中ZEB2的表達(dá)情況。
　　5）篩選出低表達(dá)和高表達(dá)ZEB2的肝癌細(xì)胞系，分別上調(diào)和下調(diào)ZEB2的表達(dá),并觀察ZEB2高、低表達(dá)對(duì)細(xì)胞成管能力及內(nèi)皮相關(guān)分子表達(dá)的影響。
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5、）Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)ZEB2高、低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)分子E-cadherin、Vimentin表達(dá)的影響。
　　7）細(xì)胞劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZEB2高、低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　8）明膠酶譜檢測(cè)ZEB2高、低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1）92例人肝癌組織樣本中發(fā)現(xiàn)17例存在VM，其發(fā)生率為18％。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)ZEB2細(xì)胞漿表

6、達(dá)53例（57.6%），ZEB2核表達(dá)21例（22.8%）。ZEB2核表達(dá)VM形成、臨床分期和肝癌患者的復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。生存分析提示具有ZEB2細(xì)胞核表達(dá)或者VM陽(yáng)性的肝癌患者總生存期均較短。多因素分析結(jié)果表明ZEB2是肝癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)。
　　2）TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，細(xì)胞由典型的上皮樣表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)樣表型并獲得了形成管道樣結(jié)構(gòu)的能力，能在體外形成VM樣結(jié)構(gòu)。

7、>　　3）TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)后的HepG2細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)錄因子ZEB2的表達(dá)顯著增強(qiáng)，而對(duì)Twist1、Snail和Slug的影響不明顯；間葉標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)增高，而上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)下降；內(nèi)皮相關(guān)分子VE-cadherin表達(dá)增高。
　　4）Western blot檢測(cè)證實(shí)在四種肝癌細(xì)胞系HepG2，Bel7402，PLC和SMMC7221
　　中，HepG2細(xì)胞低表達(dá)ZEB2，Bel7402

8、，PLC和SMMC7221細(xì)胞均有較高的ZEB2表達(dá)，其中Bel7402細(xì)胞表達(dá)最高。
　　5）HepG2細(xì)胞上調(diào)ZEB2表達(dá)后在三維培養(yǎng)下能夠形成管道樣結(jié)構(gòu)并表達(dá)內(nèi)皮相關(guān)分子VE-cadherin、Flt-1、Flk-1；Bel7402細(xì)胞下調(diào)ZEB2表達(dá)后形成管道樣結(jié)構(gòu)的能力消失并且VE-cadherin、Flt-1、Flk-1的表達(dá)顯著下降。
　　6）上調(diào)ZEB2表達(dá)使HepG2細(xì)胞間葉標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)增高

9、,而上皮標(biāo)記分子 E-cadherin表達(dá)下降；下調(diào) ZEB2表達(dá)使 Bel7402細(xì)胞間葉標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)下降,而上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)增高。
　　7）上調(diào)ZEB2表達(dá)能夠增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力。下調(diào)ZEB2表達(dá)降低肝癌Bel7402細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　8）上調(diào)ZEB2表達(dá)能夠增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞MMP-2和MMP-9的活性；下調(diào)ZEB2表達(dá)降低肝癌Bel7402細(xì)胞MMP

10、-2和MMP-9的活性。
　　結(jié)論：
　　1）通過(guò)免疫組化及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)ZEB2與VM形成有關(guān)；ZEB2還與肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān),是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。2）體外實(shí)驗(yàn)通過(guò) TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，證實(shí)其能夠通過(guò)顯著上調(diào) ZEB2的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并且促進(jìn)體外形成VM樣結(jié)構(gòu)。
　　3）體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建ZEB2上、下調(diào)細(xì)胞模型，證實(shí)ZEB2能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移性和三維管狀結(jié)構(gòu)