腸道病毒71型毒株的的全基因序列分析及重組疫苗載體的構(gòu)建.pdf

1、近二十年，手足口病在我國兒童中的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。而腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）作為手足口病的主要病原，其致病機(jī)制和免疫應(yīng)答機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)對(duì)2011年分離自廣州并保存于本室的 EV71毒株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)化特點(diǎn)進(jìn)行分析。
　　疫苗是控制傳染病流行最為有效而經(jīng)濟(jì)的手段。目前，雖然已經(jīng)開展多種 EV71疫苗的研究，并取得了一定進(jìn)展，但是至今仍未開發(fā)出有醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值的疫苗。因此，本研究進(jìn)一步

2、克隆了該 EV71毒株的 VP1基因片段，并在我室已成功構(gòu)建的柯薩奇病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）感染性載體基礎(chǔ)上，利用克隆到的 EV71 VP1片段來代替CVB3感染載體的 VP1基因片段，以期獲得表達(dá) EV71 VP1的重組病毒，為 EV71疫苗研究提供新的思路。
　　主要研究方法：
　　1.將標(biāo)本處理后，取上清接種到人橫紋肌肉瘤 RD細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增之后的病毒通過細(xì)胞培養(yǎng)蝕斑法純化；
　　

3、2.提取病毒 RNA，采用反轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA，設(shè)計(jì)的9對(duì)引物對(duì) EV71毒株全基因組進(jìn)行克隆，并在此基礎(chǔ)上對(duì)該毒株全基因組（未包括多聚腺苷酸尾）進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)定；
　　3.參考 EV71各型別的代表株以及中國大陸其它地區(qū)測(cè)定的 EV71病毒序列，應(yīng)用Bioedit、 Mega、 SimpLot等生物學(xué)軟件對(duì)該毒株的全基因組及各區(qū)段的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)的分析；
　　4.對(duì)保存在本實(shí)驗(yàn)室的 EV71毒株進(jìn)行測(cè)序、

4、分析的基礎(chǔ)上通過PCR的方法克隆出VP1蛋白的編碼序列；
　　5.本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建CVB3感染性載體，并成功包裝出病毒，經(jīng)過驗(yàn)證為減毒株。本研究通過酶切連接的方法，利用EV71的 VP1編碼序列置換出 CVB3感染載體中原有的 VP1編碼序列；
　　6.對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中EV71 VP1蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.根據(jù)測(cè)序結(jié)果，成功拼接出該 EV71毒株的基因組全序

5、列，命名為 EV71 IM11株，并已被 GenBank收錄，登錄號(hào)為 KM673244；
　　2. IM11毒株的基因組具有腸道病毒基因組的基本特征，全長7408個(gè)核苷酸（nucleotide，nt），其中5'端非編碼區(qū)743nt，3'端非編碼區(qū)89nt，兩個(gè)非編碼區(qū)之間為6579nt長的單個(gè)開放閱讀框，編碼含2193氨基酸的多聚蛋白，編碼區(qū)內(nèi)未見有核苷酸的插入或缺失；
　　3.通過進(jìn)化分析得知 IM11株為 EV71 C

6、4a基因亞型，并和分離于佛山的一株病毒有較高的同源性；
　　4.通過進(jìn)化分析，推測(cè)在我國 C4a基因亞型有兩種進(jìn)化趨勢(shì)；
　　5.克隆出 EV71 VP1基因，并利用酶切連接的方法，成功地用EV71 VP1代替 CVB3 VP1，構(gòu)建出重組質(zhì)粒；
　　6.利用蛋白標(biāo)記方法檢測(cè)出重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中有 EV71 VP1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　本研究獲得2011年分離自廣州保存于本室的 EV71毒株全基因