SPARC的造血調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　 干細(xì)胞壁龕是干細(xì)胞生存的特定微環(huán)境，直接影響HSC的自我更新、增殖和分化。造血干細(xì)胞壁龕細(xì)胞（包括成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）均高表達(dá)富含半胱氨酸的酸性分泌型蛋白(SPARC)。本文通過分析SPARC基因缺失型小鼠體內(nèi)造血組織結(jié)構(gòu)和造血發(fā)育特點(diǎn)，以及外源性SPARC對造血干細(xì)胞的遷移和增殖作用，了解SPARC對造血的調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 1）SPARC基因缺失雜合子小鼠交配，繁育出子代后，提取鼠尾

2、gDNA，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增SPARC和Neo基因；然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)；WB檢測經(jīng)PCR方法鑒定出的SPARC基因各表型小鼠脾臟組織SPARC蛋白的表達(dá)。
　　 2）比較SPARC基因缺失純合子小鼠和野生型對照鼠骨小梁數(shù)量，脾臟的大小、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)和LTC-IC、集落培養(yǎng)方法檢測骨髓中造血干/祖細(xì)胞的含量；體外檢測外源性SPARC對CD34＋細(xì)胞的擴(kuò)增，遷移的影響。
　　

3、結(jié)果：
　　 1）PCR擴(kuò)增片段經(jīng)限制性酶切反應(yīng)證實(shí)為特異性SPARC和Neo基因擴(kuò)增產(chǎn)物；經(jīng)PCR方法鑒定得到的SPARC基因純合子小鼠不能檢測到SPARC蛋白的表達(dá)，而野生型小鼠可檢測到SPARC蛋白的表達(dá)；
　　 2）SPARC基因缺失小鼠較野生型小鼠單位體積內(nèi)的骨小梁數(shù)目減少34.5％，骨小梁分離度增加65.6％；缺失鼠脾臟重量、脾臟/體重比均大于野生型對照鼠；脾臟組織切片HE染色顯示缺失鼠白髓面積明顯增大；缺失

4、型小鼠體內(nèi)造血與野生型小鼠比較有如下差異：外周血WBC、HGB、HCT均減少；RBC減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；骨髓KSL(c-kit＋,sca-1＋,lin－)細(xì)胞的比例、KSL細(xì)胞總數(shù)均減少；長期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞(LTC-IC)明顯減少；BFU-E形成數(shù)明顯減少，CFU-GM數(shù)量無明顯差異；此外，SPARC基因缺失鼠骨髓細(xì)胞自殺率明顯低于野生型對照鼠。CD34＋細(xì)胞，在有或沒有SPARC的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7天，加入SPARC組造血干細(xì)胞的增殖明