hFLVCR對紅系造血調(diào)控的研究.pdf

1、人類貓白血病C亞類病毒受體(Human Feline LelJkemia VirusRecep—tor，hFLVCR)廣泛表達(dá)于CD34+造血干／祖細(xì)胞、血液細(xì)胞及其他人類組織和細(xì)胞系(如K562等)<'(1-2)>。最新研究發(fā)現(xiàn)hFLVCR有輸出血紅素(heme)的重要功能，<'(3)>從而可能在紅系的早期分化過程中起重要作用，因此引起人們的關(guān)注。目前hFLVCR對于紅系造血的作用和機(jī)制尚未完全闡明。有關(guān)FLVCR的功能和病理生理意義

2、的研究在國外尚處于起步階段，國內(nèi)更無報(bào)道，故這是一個有待深入探討的領(lǐng)域。 目的：1．體外動態(tài)觀察氯高鐵血紅素(Hemin，Hm)誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化過程中hFLVCR的蛋白和mRNA的表達(dá)，以明確hFLVCR與紅系造血之間的關(guān)系。2．將hFLVCR反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染K552細(xì)胞，封閉的含量及K562細(xì)胞的凋亡狀況，旨在探討hFLVCR對紅系造血的影響hFLVCR的功能。通過細(xì)胞化學(xué)染色、免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)等，觀察K562

3、細(xì)胞向紅系分化情況、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)和機(jī)制。 方法：1．用MTT法觀察誘導(dǎo)劑Hm對K562細(xì)胞增殖的影響。2.采用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，動態(tài)觀察氯高鐵血紅素誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化過程中hFLVCR的蛋白和mRNA的表達(dá)。3.用免疫組化法觀察轉(zhuǎn)染hFLVCR反義寡核苷酸，阻斷hFLVCR的表達(dá)后，K562細(xì)胞表面hFINCR蛋白的表達(dá)情況。4用細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)等，觀察轉(zhuǎn)染：hFLVC

4、R反義寡核苷酸后，對K562細(xì)胞向紅系分化及凋亡的影響。5．用TBA法觀察轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量變化。 結(jié)果：1．在實(shí)驗(yàn)濃度(50μM)誘導(dǎo)劑Hm對K562生長增殖沒有影響。2．誘導(dǎo)后K562向紅系分化過程中，hFLNCR蛋白表達(dá)隨誘導(dǎo)時間延長其表達(dá)呈下降趨勢，而對照組基本穩(wěn)定在一個水平，在3d、5d時間點(diǎn)與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。3．hFLNCR反義寡核苷酸及脂質(zhì)體對K562

5、細(xì)胞生長增殖沒有影響。4．轉(zhuǎn)染hFLNCR反義寡核苷酸后的K562細(xì)胞，其表面hFLVCR蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度與對照組相比明顯減弱，幾乎接近陰性對照組。5．聯(lián)苯胺染色法觀察到的陽性細(xì)胞百分率，在12h，24h，48h各時間點(diǎn)，control組呈明顯增加趨勢，不同時間點(diǎn)陽性率的比較有顯著性差異(P<0.05)。而ASONs／lipofectin組的陽性細(xì)胞百分率隨誘導(dǎo)時間延長越來越低，且不同時間點(diǎn)陽性率比較有顯著性差異，P(P<0.001)

6、。6．轉(zhuǎn)染hFINCR反義寡核苷酸后，其他對照組K562細(xì)胞MDA含量基本波動在1.35左右(單位nmol／ml)，而ASONs／lipofectin組在6h、12h、24h、48h時間點(diǎn)的MDA含量呈逐漸增加的趨勢，且各時間點(diǎn)之間比較P<0.05，說明均有顯著性差異。7．流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡， ASONs／lipofectin組在0h，3h，12h，24h，48h的凋亡百分率隨時間逐漸增加(P<0.001)。而其他各組細(xì)胞凋亡百分率

7、與時間關(guān)系不明顯(p>0.05)。 結(jié)論：1．本研究發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞向紅系分化成熟過程中，hFLNCR的蛋白和mRNA的表達(dá)在早期階段高，隨著細(xì)胞的成熟而下調(diào)，說明hFLVCR與紅系造血有關(guān)。2．采用反義寡核苷酸抑制K562細(xì)胞表面hFINCR的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)過多的血紅素通過對細(xì)胞膜的氧化性損害，誘導(dǎo)凋亡，同樣使細(xì)胞分化障礙。3．研究提示血紅素的輸出是體內(nèi)紅系生存和早期分化所必需的過程，hFLVCR通過輸出游離的血紅素，保護(hù)紅系