PRMT1-RBM15調(diào)控通路在正常造血調(diào)控和惡性造血疾病中作用機(jī)制的研究.pdf

1、蛋白精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶1（Protein Arginine Methlytransferase1，PRMT1）是蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族的主要成員。PRMT1有多種組氨酸和非組氨酸底物，它通過甲基化這些底物調(diào)控蛋白-蛋白間和蛋白-核酸間的相互作用，發(fā)揮表觀遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA剪接、RNA輸出和信號傳導(dǎo)功能。PRMT1通過甲基化Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Runt-related Transcription Factor1，RUNX1)激活轉(zhuǎn)

2、錄調(diào)節(jié)造血。在AML1-ETO的急性髓系白血?。ˋcute Myeloid Leukemia，AML）中，PRMT1與AML1-ETO相互作用，敲低PRMT1的表達(dá)能減少由AML1-ETO激活的相關(guān)基因表達(dá)，減少白血病細(xì)胞的增殖并抑制它們的自我更新。PRMT1在新診斷出的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)顯著增高。RNA結(jié)合蛋白15（RNA Binding Motif Protein15，RBM15）是由位于1號染色體的上的RBM15/

3、OTT基因編碼的RNA結(jié)合蛋白。它能與核RNA輸出因子1(Nuclear RNAexport factor1，NXF1)相結(jié)合并直接識別RNA輸出元素(RNA Transport Element，RTE)，輔助輸出含有RTE的基因，促進(jìn)基因的表達(dá)，參與輸出通路發(fā)揮核輸出功能。RBM15與c-Myc結(jié)合調(diào)節(jié)成人造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化。在RBM15基因敲除的成年小鼠中髓細(xì)胞及巨核細(xì)胞增生異常，并且由于在前B細(xì)胞的分化階段受到阻滯，導(dǎo)致使外

4、周B細(xì)胞缺失。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRMT1甲基化RBM15蛋白的R578位點(diǎn)，導(dǎo)致甲基化的RBM15蛋白經(jīng)過E3連接酶介導(dǎo)的泛素化降解，RBM15直接與RUNX1和GATA1的pre-mRNA的內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合后與SF3B1作用調(diào)控它們的RNA可變剪接。但是PRMT1-RBM15在正常造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞及髓系細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制仍不清楚。
　　眾多研究發(fā)現(xiàn)許多造血系統(tǒng)疾病發(fā)生表觀遺傳調(diào)控異常和RNA剪切功能的異常。骨髓增生

5、異常綜合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)是一組異質(zhì)的克隆性干細(xì)胞疾病。它的特征是至少一個(gè)造血譜系的發(fā)育不良和無效造血，且具有發(fā)展為急性髓系白血病的危險(xiǎn)?；驕y序結(jié)果顯示大約80％的MDS患者攜帶基因突變，例如表觀遺傳調(diào)節(jié)基因(TET2，ASXL1，DNMT3A，IDH1，IDH2，EZH2)，轉(zhuǎn)錄因子（ETV6，RUNX1，TP53），信號傳導(dǎo)蛋白(CBL，JAK2，KRAS，NRAS)和與RNA剪接機(jī)制相

6、關(guān)的基因（SF3B1，SRSF2，U2AF1，ZRSR2）。80％以上的MDS亞型環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞性貧血的患者發(fā)生剪切因子3b亞型1(Splicing Factor3b Subunit1，SF3B1)的基因突變。SF3B1K700E是SF3B1突變最常見的突變位點(diǎn)。SF3B1的突變?nèi)绾螌?dǎo)致紅細(xì)胞生成缺陷的分子機(jī)制仍不清楚。RBM15的RIP-seq分析顯示，RBM15與SF3B1和TAL1的內(nèi)含子區(qū)域相結(jié)合。TAL1基因編碼一個(gè)具有螺旋-

7、環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，是在造血過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。它對早期造血和成人造血中紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞生成有重要作用。TAL1基因有多個(gè)啟動(dòng)子，可編碼產(chǎn)生全長的TAL1(TAL1 full-length，TAL1fl)蛋白及短的TAL1(TAL1 short-form，TAL1s)蛋白。此外，TAL1fl mRNA可通過使用在N-末端區(qū)域部分的不同翻譯起始位點(diǎn)產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。TAL1s的N末端沒有DNA結(jié)合域，TAL1s的過表達(dá)促進(jìn)了小鼠骨

8、髓細(xì)胞的紅細(xì)胞分化。所以我們推測PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之間的相互作用的失調(diào)可能在MDS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究第二部分中我們重點(diǎn)闡述了PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之間的關(guān)系。
　　急性巨核細(xì)胞白血?。ˋcute Megakaryoblastic Leukemia，AMKL）中t(1;22)(p13;q13)染色體易位比較常見，這種易位使得1號染色體上RBM15基因和22號染色體上MKL

9、1基因形成融合基因RBM15-MKL1（又叫OTT-MAL）。RBM15和MKL1都是巨核細(xì)胞分化的重要基因，RBM15-MKL1融合基因?qū)氲男∈罂梢园l(fā)生像RBM15敲除小鼠一樣的巨核細(xì)胞分化缺陷。雖然RBM15-AMKL轉(zhuǎn)基因小鼠AMKL的發(fā)病率很低，但是當(dāng)將骨髓增殖白血病基因的突變體(Myloproliferative Leukemia virus mutant，MPLW515L)轉(zhuǎn)入RBM15-MKL1骨髓后，它的AMKL的發(fā)病

10、率為100％。6133細(xì)胞系是從RBM15-MKL1轉(zhuǎn)基因的小鼠脾臟分離出來的細(xì)胞系，它的存活需要依賴干細(xì)胞因子(Stem Cell Factor，SCF)。我們前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在6133細(xì)胞里過表達(dá)MPLW515L時(shí)激活了PRMT1的表達(dá)，并能夠使6133細(xì)胞呈現(xiàn)無依賴因子的生長。生物信息技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，PRMT1在急性巨核細(xì)胞白血病中表達(dá)增高。DB75已經(jīng)在不同的生物系統(tǒng)被用作研究PRMT1的功能，它能透過293T細(xì)胞的細(xì)胞膜并抑制PR

11、MT1的活性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PRMT1抑制劑DB75能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化成熟，并且能逆轉(zhuǎn)PRMT1導(dǎo)致的巨核細(xì)胞分化障礙。在正在培養(yǎng)的白血病細(xì)胞MEG01細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入20μM的DB75，72h后顯著抑制了它們的生長。但是RBM15-MKL1融合基因?qū)е碌陌籽∈欠褚簿哂蠵RMT1表達(dá)增高的特性，以及抑制PRMT1的活性能否抑制白血病的異常增殖需要我們進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，本研究主要從三個(gè)部分探討PRMT1

12、-RBM15調(diào)控通路在正常造血調(diào)控和疾病中的作用機(jī)制。第一，PRMT1-RBM15調(diào)控通路在正常紅系及巨核系細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制;第二，PRMT1-RBM15調(diào)控通路在SF3B1K700E突變相關(guān)紅系異常造血中的作用機(jī)制;第三，PRMT1-RBM15調(diào)控通路在RBM15-MKL1融合基因相關(guān)AMKL中的作用機(jī)制。此研究的目的旨在探討PRMT1-RBM15調(diào)控通路是否能夠作為治療相關(guān)造血系統(tǒng)疾病的潛在靶點(diǎn)。
　　第一部分:PRM

13、T1-RBM15調(diào)控通路在正常紅系和巨核系分化過程中的作用機(jī)制研究
　　目的
　　以正常臍血干細(xì)胞為研究對象，研究PRMT1-RBM15調(diào)控通路在正常造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞及紅細(xì)胞分化過程中的作用。
　　方法:
　　收集正常孕婦胎兒臍血，肝素抗凝，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分選出單個(gè)核細(xì)胞，用磁珠分選儀分離臍血CD34+細(xì)胞。用磷酸鈣包裝病毒的方法分別包裝PRMT1，RBM15，shPRMT1，shRBM15＃1，shRB

14、M15＃2慢病毒，用PEG6000的方法把這些病毒濃縮為原體積的1/100。用這些病毒按照常規(guī)侵染懸浮細(xì)胞的方法分別侵染CD34+細(xì)胞。侵染48h后，用流式細(xì)胞學(xué)的方法或者用嘌呤霉素獲得陽性細(xì)胞，并把這些陽性細(xì)胞分別在2IU/ml的EPO和50ng/ml的TPO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7天后應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)方法分別檢測代表紅細(xì)胞生成的表面抗原CD71和代表成熟巨核細(xì)胞表面抗原CD41，CD42的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.PRMT1-

15、RBM15調(diào)控通路調(diào)控著造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化。在CD34+臍血干細(xì)胞中過表達(dá)RBM15或者用PRMT1抑制劑(DB75)抑制PRMT1活性時(shí)，生成的成熟巨核細(xì)胞的數(shù)目增多;過表達(dá)PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15時(shí)，生成的成熟巨核細(xì)胞的數(shù)目減少。
　　2.PRMT1-RBM15調(diào)控通路調(diào)控著造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞分化。在CD34+臍血干細(xì)胞中過表達(dá)PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15時(shí)，生成的紅細(xì)胞增多;過表

16、達(dá)RBM15或者用PRMT1抑制劑(DB75)抑制PRMT1活性時(shí)，生成的紅細(xì)胞減少。
　　第二部分:PRMT1-RBM15調(diào)控通路在SF3B1K700E突變相關(guān)紅系異常造血中的作用機(jī)制研究
　　目的:
　　研究PRMT1-RBM15調(diào)控通路在SF3B1K700E引起的骨髓增生異常綜合征中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.用Real-time PCR及Western Blot的方法分析PRMT1-RBM15

17、調(diào)控通路的改變是否影響TAL1兩種異構(gòu)體的表達(dá)。
　　2.構(gòu)建Flag-TAL1s，F(xiàn)lag-TAL1fl慢病毒質(zhì)粒，用慢病毒原液侵染K562細(xì)胞,48h后，用流式細(xì)胞儀分選出陽性細(xì)胞。提取這些陽性細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR的方法分析內(nèi)源性的TAL1s、TAL1fl、ALAS2、β-globin和γ-globin的表達(dá)。用Benzidine染料分別對上述的陽性細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡計(jì)數(shù)經(jīng)Benzidi

18、ne染色的陽性細(xì)胞，了解紅細(xì)胞比例。構(gòu)建TAL1s，TAL1fl的慢病毒質(zhì)粒，用磷酸鈣的方法包裝病毒，用PEG6000的方法把病毒按照1∶100的比例濃縮。用濃縮后的病毒按照侵染懸浮細(xì)胞的方法侵染人類臍血CD34+細(xì)胞。48h后，用流式細(xì)胞儀分選出病毒侵染陽性細(xì)胞，并分別把這些陽性細(xì)胞培養(yǎng)在含有2IU/ml的EPO的培養(yǎng)基中，7天后流式細(xì)胞學(xué)檢測代表紅細(xì)胞生成的表面抗原CD71的表達(dá)。
　　3.用磷酸鈣的方法分別將Flag-TAL

19、1s、Flag-TAL1fl、Flag-TAL1s+ETO2、Flag-TAL1fl+ETO2轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，48h后收取總蛋白，免疫共沉淀純化出Flag蛋白后用Western Blot的的方法檢測ETO2的表達(dá)。分別收取在K562細(xì)胞中過表達(dá)Flag-TAL1s，F(xiàn)lag-TAL1fl的陽性細(xì)胞的總蛋白，用上述同樣的方法檢測檢測ETO2的表達(dá)。
　　4.野生型Flag-SF3B1和突變型SF3B1K700E慢病毒質(zhì)粒來自美國

20、Sloan-Kettering癌癥中心，提取質(zhì)粒，送金唯智測序公司測序。測序正確后，用磷酸鈣的方法包裝慢病毒，用病毒原液侵染K562細(xì)胞，48h后，用流式細(xì)胞儀分選出病毒侵染陽性細(xì)胞，收取細(xì)胞的總蛋白，免疫共沉淀的方法純化出Flag蛋白，用Western Blot的方法分析RBM15的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.PRMT1-RBM15調(diào)控通路調(diào)控著TAL1的可變剪接。PRMT1的表達(dá)增高或者用shRNA的方法使RBM15的表

21、達(dá)敲低時(shí)，TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率增高，產(chǎn)生的TAL1s增多。RBM15的表達(dá)增高和用shRNA敲低PRMT1的表達(dá)或者用PRMT抑制劑DB75使PRMT1活性減低時(shí)，TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率減低，產(chǎn)生的TAL1fl增多。
　　2.TAL1s能促進(jìn)紅細(xì)胞的成熟分化。當(dāng)Flag-TAL1s和Flag-TAL1fl在K562細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，它們的細(xì)胞沉淀變紅;與TAL1fl過表達(dá)的K56

22、2細(xì)胞相比，TAL1s過表達(dá)的K562細(xì)胞細(xì)胞沉淀變得更紅。Real-time PCR分析顯示TAL1s的表達(dá)增高沒有使內(nèi)源性的TAL1s或TAL1fl的mRNA水平增高，但是TAL1fl的表達(dá)增高使內(nèi)源性的TAL1fl增高，而內(nèi)源性的TAL1s增高并不明顯。TAL1s的表達(dá)增高促進(jìn)K562細(xì)胞產(chǎn)生更多的β-globin的mRNA，TAL1fl和TAL1s激活了負(fù)責(zé)血紅素生成基因ALAS2的轉(zhuǎn)錄。TAL1s過表達(dá)的K562細(xì)胞經(jīng)Benz

23、idine染色的陽性細(xì)胞比例高于TAL1fl過表達(dá)K562細(xì)胞的陽性細(xì)胞比例。雖然在臍血干細(xì)胞中過表達(dá)TAL1s和TAL1fl都能使紅細(xì)胞生成增多，但是TAL1s能更有效地生成更多的紅細(xì)胞。同樣在臍血干細(xì)胞中過表達(dá)PRMT1也能使造血干細(xì)胞產(chǎn)生更多的CD71紅細(xì)胞。
　　3.TAL1兩種異構(gòu)體與轉(zhuǎn)錄抑制因子ETO2的結(jié)合不同。不管是在293T細(xì)胞中或者在K562細(xì)胞中，TAL1fl與ETO2相互結(jié)合，但是TAL1s不與ETO2結(jié)合

24、。有文獻(xiàn)指出ETO2抑制紅系發(fā)育，所以TAL1s通過不與ETO2結(jié)合促進(jìn)紅系發(fā)育。
　　4.SF3B1K700E突變體與RBM15的相互作用增強(qiáng)影響TAL1的mRNA可變剪接。與野生型的SF3B1相比，RBM15與突變型的SF3B1結(jié)合增多。突變體SF3B1使TAL1fl的mRNA水平增高更多進(jìn)而使TAL1s/TAL1fl的mRNA比率減少。野生型的SF3B1使血紅蛋白生成相關(guān)基因ALAS2、γ-globin和β-globin的m

25、RNA水平增高，但是SF3B1突變體不增加它們的mRNA水平。
　　第三部分:PRMT1-RBM15調(diào)控通路在RBM15-MKL1融合基因相關(guān)AMKL中的作用機(jī)制研究
　　目的:
　　研究PRMT1-RBM15調(diào)控通路在RBM15-MKL1融合基因?qū)е碌募毙跃藓思?xì)胞白血病中的作用機(jī)制。
　　研方法:
　　1.按照第二部分中分離臍血CD34+細(xì)胞的方法分離臍血CD34+細(xì)胞，用磷酸鈣包裝病毒的方法包裝RBM1

26、5-MKL1和MPLW515L慢病毒，PEG6000的方法把病毒原液濃縮為原體積1/100。用常規(guī)侵染懸浮細(xì)胞的方法分別用RBM15-MKL1，RBM15-MKL1+MPLW515L，MPLW515L慢病毒侵染CD34+細(xì)胞。48h后，用流式細(xì)胞儀分選出陽性或雙陽性的細(xì)胞。1）培養(yǎng)在CD34+細(xì)胞成長的培養(yǎng)基中，每天細(xì)胞計(jì)數(shù);2）利用細(xì)胞克隆分析試劑盒做細(xì)胞連續(xù)克隆形成分析;3)培養(yǎng)在巨核細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，7天后使用流式細(xì)胞學(xué)方法分析細(xì)

27、胞表面CD41 CD42的表達(dá)。4）Real-time PCR方法分析PRMT1的mRNA水平，流式細(xì)胞學(xué)方法分析PRMT1蛋白水平。
　　3.在1中分選的過表達(dá)RBM15-MKL1+MPLW515L的雙陽性細(xì)胞中加入PRMT1抑制劑DB75。1）應(yīng)用細(xì)胞活性分析試劑盒分析DB75對細(xì)胞活性的影響;2）利用細(xì)胞克隆試劑盒做細(xì)胞連續(xù)克隆形成分析;3）培養(yǎng)在巨核細(xì)胞培養(yǎng)基中并在7天后使用流式細(xì)胞學(xué)方法分析細(xì)胞表面CD41 CD42的表

28、達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.RBM15-MKL1融合蛋白和MPLW515L突變體共同作用能使臍血干細(xì)胞長期增殖。當(dāng)RBM15-MKL1和MPLW515L共同表達(dá)在臍血CD34+細(xì)胞時(shí)能夠在造血干細(xì)胞培養(yǎng)基中長期存活，并且能夠在含有CD34+細(xì)胞成長的細(xì)胞因子混合物的甲基纖維素的培養(yǎng)基中長期增殖。RBM15-MKL1+MPLW515L共同表達(dá)抑制了造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化。不管是mRNA或者是蛋白水平，PRMT1在RBM15-M

29、KL1和MPLW515L共同表達(dá)的臍血CD34+細(xì)胞中都增高。
　　2.PRMT1抑制劑DB75能抑制RBM15-MKL1+MPLW515L轉(zhuǎn)化的CD34+細(xì)胞的增殖。當(dāng)我們在RBM15-MKL1+MPLW515L共同表達(dá)的細(xì)胞加入DB75時(shí)，這些細(xì)胞在三天內(nèi)停止生長并死亡。DB75能使RBM15-MKL1+MPLW515L共同表達(dá)的細(xì)胞在甲基纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成停止。PRMT1抑制劑DB75能夠逆轉(zhuǎn)RBM15-MK

30、L1和MPLW515L導(dǎo)致的白血病模型的巨核細(xì)胞成熟障礙，使成熟巨核細(xì)胞數(shù)目增多。
　　結(jié)論:
　　1.PRMT1-RBM15調(diào)控通路在正常造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞及紅細(xì)胞分化的過程中具有重要的調(diào)控作用。
　　2.在SF3B1K700E突變的骨髓增生異常綜合征中，RBM15與SF3B1K700E的結(jié)合增強(qiáng)，導(dǎo)致TAL1s的減少從而引起紅細(xì)胞成熟分化減少。PRMT1的增高引起TAL1s的增加引起與紅細(xì)胞成熟分化相關(guān)的基因AL