RNAi抑制Tctex5在雄性鼠生殖細胞中的表達及意義.pdf

1、全世界范圍內，人類不育影響著大約10％～15％的夫婦。不育的原因夫婦雙方各占一半【1】【2】【3】。臨床上>40％的男性不育患者原因不清，并且常伴有無精或少精癥[4]。更令人擔憂的是因為環(huán)境污染和化學制劑使得人類精子的質量正在減少，并認為引起基因突變【5】【6】。男性生殖功能障礙與生殖相關基因突變的研究是目前生殖領域的研究熱點之一【7】。Tctex5（Expression of T-complex testis expressed 5）

2、基因是在老鼠的精子中發(fā)現(xiàn)的一種新型的酶調節(jié)因子，主要在老鼠的睪丸和精子中豐富表達。Tctex5基因在精子發(fā)生中的調控機制研究，國內尚未見報導。Tctex5基因在人類稱作Ppp1r11，即蛋白質磷酸酶1亞調節(jié)單位11(protein phosphatase-1 inhibitor-3)。Ppp1r11在睪丸中的潛在角色尚不清楚。Ppp1r1編碼一種特異的蛋白質磷酸1（PP1）抑制劑：絲氨酸/蘇氨酸磷酸。Ppp1r1作為一個未知功能的基因，

3、可能參與了精子發(fā)生過程的調控。
　　RNAi通過相應的dsRNA特異地降調同源mRNA，從而導致轉錄后基因沉默，這一技術已成功應用于對未知功能基因的的研究。dsRNA能通過RNAi機制介導同源基因的沉默，RNAi是一種進化上保守機制，一個階梯式的過程，通過RNaseⅢ樣活性的核酸酶（Dicer酶）在體內產生有活性的小干擾RNA（siRNA）。siRNA有一個特征結構：兩條單連末端為5’端磷酸和3’端羥基，此外每條單鏈的3’端均有2

4、～3個突出的非配對堿基，21-23nt的siRNA能降調同源RNA。RNAi已被廣泛應用于基因功能的研究，包括在果蠅、線蟲、錐蟲、小鼠及哺乳動物中相繼發(fā)現(xiàn)存在RNAi現(xiàn)象。
　　本研究旨在設計并獲得能夠特異下調基因表達的小干擾RNA，并檢測所獲得的siRNA能否引起雄性鼠生殖細胞中Tctex5基因的沉默。為研究Ppp1r11的功能和產生特異轉錄基因敲除的小鼠提供技術手段，對進一步了解Ppp1r11在精子發(fā)生過程中的潛在作用具有重要

5、意義。盡管Tctex5基因的調控機制目前還不清楚。但對于進一步了解精子發(fā)生的分子和細胞機理，對于發(fā)育生物學、生命起源及生育控制具有重要的意義。
　　目的：以Ppp1r11基因為靶基因，采用RNA干擾(RNAi)技術特異性地抑制CRL-1715、CRL－2053、CRL-2196細胞中Ppp1r11的表達。
　　方法：針對Ppp1r11基因設計一段小干擾RNA(siRNA)，由Ambion公司化學合成，用脂質體siPORTTT

6、MNeoFXTM轉染試劑盒將該siRNA轉染CRL-1715、CRL－2053、CRL-2196三種細胞，采用RT-PCR和Westernblot分別從mRNA和蛋白質水平檢測該siRNA對表達的影響。
　　結果：針對Ppp1r11的siRNA能夠明顯下調CRL-1715、CRL－2053、CRL-2196三種細胞中Ppp1r11的表達水平，并具有良好的特異性。
　　結論：在CRL-1715、CRL－2053、CRL-219