轉(zhuǎn)錄因子Sp1、Sp3對K562白血病細胞增殖、凋亡及耐藥性影響的研究.pdf

1、目的：急性白血病(acuteleukemia，AL)是血液系統(tǒng)常見的惡性疾病，近年來其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。隨著新的化療藥物的不斷出現(xiàn)以及造血干細胞移植技術的不斷進步，其近期和遠期療效有了明顯的提高，但是有些患者在治療過程中出現(xiàn)原發(fā)或者繼發(fā)的多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)現(xiàn)象，導致化療失敗。MDR指腫瘤一旦對某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，就同時對其他結(jié)構(gòu)上無關、作用機理各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，是一種特殊的廣譜

2、耐藥現(xiàn)象。 耐藥細胞株的建立是探討惡性腫瘤MDR現(xiàn)象的機制及其逆轉(zhuǎn)研究的基礎。以往研究中建立耐藥細胞株多采用藥物低濃度加量持續(xù)誘導法，這與臨床短療程、大劑量、反復用藥的方式不一致。本研究模擬臨床用藥特點，采用高濃度反復間歇誘導的方法，建立白血病細胞株K562對VP-16等多藥耐藥細胞系K562/VP。 足葉乙甙(etoposide，VP-16)是半合成的鬼臼毒素衍生物，屬于拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ，To

3、poⅡ)毒性抑制劑，主要通過穩(wěn)定TopoⅡ-DNA斷裂復合體，抑制DNA的再連接，造成DNA斷裂損傷。VP-16是白血病化療的常用藥物，與阿糖胞苷聯(lián)合構(gòu)成的AE方案總有效率可達45％，尤其對于M4和M5效果更佳，MDR現(xiàn)象是其化療失敗的重要因素之一。 K562細胞系于1977年建立，遺傳背景清楚，生物學性狀穩(wěn)定。經(jīng)檢索國內(nèi)、外文獻，未見由VP-16誘導的K562細胞耐藥亞系建立的報道。目前用于研究白血病耐藥相關研究的理想模型較少

4、，因此，K562/VP的建立對今后從細胞和分子水平研究白血病多藥耐藥機制具有較大的實用價值，也為體外篩選化療藥物，研究耐藥逆轉(zhuǎn)等提供了必要的實驗材料。 引起白血病的耐藥機制非常復雜，通常有多種因素參與其中。目前已經(jīng)明確的與耐藥有關的機制有：1、具有外排泵作用的膜蛋白表達水平升高，如：細胞膜上的多藥耐藥蛋白1(multidrugresistanceprotein1，mdr-1/p-170)/P-糖蛋白(P-glycoprotein

5、，P-gp)多藥耐藥相關蛋白(multidrugresistancerelatedprotein，MRP)；細胞核核孔蛋白表達升高，如：肺耐藥蛋白(lungresistance-relatedprotein，LRP)等，細胞通過這些膜上的外排泵將化療藥物排出細胞，導致細胞內(nèi)的藥物濃度降低，達不到有效治療濃度引起耐藥。2、酶系統(tǒng)異常，如：細胞核酶：拓撲異構(gòu)酶(topoisomeraseⅡ，TopoⅡ)，細胞漿酶：谷光苷肽S轉(zhuǎn)移酶π(Glu

6、tathioneStransferaseGST-π)、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)等，這些酶參與多種化療藥物作用過程，它們表達水平的改變將直接影響藥物的化療效果。3、抗凋亡作用，如抗凋亡基因bcl-2、C-myc等過度表達，導致細胞對化療藥物殺傷引起的細胞凋亡反應性下降，從而引發(fā)耐藥。其中對被稱為經(jīng)典耐藥途徑的具有外排泵的膜蛋白研究較多，也較為深入。而對于酶系統(tǒng)異常的研究尚不十分透徹。 VP-16所產(chǎn)生的耐

7、藥機主要由于藥物作用后引起的TopoⅡ含量或活性降低、基因變異、在細胞內(nèi)分布的改變，但目前對引起這些現(xiàn)象的機制研究仍較少。因此，在建立K562/VP的基礎上，可以針對調(diào)節(jié)耐藥細胞中TopoⅡα和TopoⅡβ表達調(diào)控進行深入研究。 TopoⅡ的表達受到啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，在TopoⅡ的啟動子區(qū)包含了2個GC盒(GC1和GC2)，5個反轉(zhuǎn)的CCAAT盒(invertedCCAATbox，ICB1～5)和1個ATF元件，而無常見的

8、TATA盒。研究表明，特化蛋白1(specificityprotein1，Sp1)是TopoⅡ的啟動區(qū)活性的激活劑，而特化蛋白3(specificityprotein3，Sp3)被證實是TopoⅡ啟動區(qū)活性的潛在抑制劑，TopoⅡ的表達主要受到轉(zhuǎn)錄因子Sp家族調(diào)控。 本研究首先采用順鉑和足葉乙甙聯(lián)合應用判斷在常規(guī)化療中TopoⅡ所起的變化，并分析其上游調(diào)控因子Sp1和Sp3在化療中發(fā)揮的作用。 采用VP-16高濃度反復間

9、歇誘導法建立K562/VP多藥耐藥細胞系。在建立K562/VP的基礎上，使用RT-PCR、蛋白印跡(Westernblotting)等方法檢測K562/VP的TopoⅡα和TopoⅡβ、P-gp、LRP、bcl-2等耐藥相關基因mRNA與蛋白的表達，同時檢測TopoⅡα和TopoⅡβ上游調(diào)控因子Sp1和Sp3的表達，以期能深入探討K562/VP的耐藥機制。 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人Sp1和Sp3表達型質(zhì)粒進入K562/VP細胞中，增強S