腺病毒介導(dǎo)靶向VEGFsiRNA對(duì)K562細(xì)胞凋亡及凋亡抑制基因survivin表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的: 構(gòu)建攜帶靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子小干擾RNA（VEGF siRNA）的重組腺病毒質(zhì)粒，收獲高滴度的重組腺病毒，為進(jìn)一步研究提供載體工具。 方法: 采用定向克隆的方法將靶向VEGF siRNA插入穿梭質(zhì)粒pSES-HUS，酶切及基因測(cè)序鑒定，命名為pSES-VEGFsi；采用同源重組方法將pSES-VEGFsi與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1連接，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd5-VEGFsi。酶切鑒定pAd5-V

2、EGFsi，以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其導(dǎo)入包裝細(xì)胞HEK293，熒光顯微鏡觀察pAd5-VEGFsi在細(xì)胞內(nèi)包裝及擴(kuò)增，通過乒乓感染并用氯化銫密度梯度離心法獲得高滴度的重組腺病毒Ad5-VEGFsi。 結(jié)果: （1）酶切及基因測(cè)序證實(shí)重組腺病毒質(zhì)粒pAd5-VEGFsi構(gòu)建成功。 （2）熒光顯微鏡證實(shí)重組腺病毒Ad5-VEGFsi成功導(dǎo)入HEK293包裝細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)得到良好表達(dá)。 （3）獲得了高滴度重組腺病毒A

3、d5-VEGFsi，病毒滴度約為4.6×1011pfu/ml。 結(jié)論: 成功構(gòu)建了攜帶靶向VEGF siRNA的重組腺病毒質(zhì)粒，并收獲高滴度重組腺病毒Ad5-VEGFsi，為進(jìn)一步的研究打下了良好的基礎(chǔ)。 目的: 采用腺病毒介導(dǎo)VEGF siRNA（即攜帶VEGF siRNA的重組腺病毒）沉默白血病K562細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，檢測(cè)K562細(xì)胞增殖及凋亡情況，并進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)survlvln基因的表達(dá)，

4、探討VEGF在白血病發(fā)病中的作用及VEGF與survlvln在白血病發(fā)病中的關(guān)系。 方法: 應(yīng)用第一部分成功構(gòu)建的攜帶靶向VEGF siRNA的重組腺病毒（Ad5-VEGFsi）感染K562細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為三組：實(shí)驗(yàn)組（K562/Ad5-VEGFsi）、空載體組（K562/Ad5）、空白塒照組（K562）。通過RT-PCR方法分別檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA及survivin mRNA表達(dá)；ELISA方法檢測(cè)K56

5、2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌：Western blot法檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)survivin蛋白表達(dá)；MTT法檢測(cè)K562細(xì)胞增殖及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果: （1）三組細(xì)胞中均有VEGF mRNA表達(dá)及其蛋白的分泌；同時(shí)，在三組細(xì)胞中也檢測(cè)到survlvin mRNA及其蛋白的表達(dá)。 （2）實(shí)驗(yàn)組VEGF mRNA表達(dá)量及其蛋白濃度分別為（0.25±0.06）、（1120.74±14.55）pg/ml

6、，與空載體組及空白對(duì)照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。 （3）實(shí)驗(yàn)組survlvin mRNA及其蛋白表達(dá)量分別為（0.42±0.03）、（0.26±0.01），與空載體組及空白對(duì)照組相比也明顯降低（p<0.01）。 （4）實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為（16.45±0.14）％較空載體組及空白對(duì)照組明顯增加（p<0.01）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生存力下降，增殖受到抑制，與空載體組及空白對(duì)照組相比有顯著差異（p<0.01

7、）。 結(jié)論: （1）人白血病K562細(xì)胞表達(dá)VEGF mRNA并分泌VEGF蛋白。 （2）攜帶靶向VEGF siRNA的重組腺病毒Ad5-VEGFsi可明顯抑制K562細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)及VEGF蛋白分泌。 （3）K562細(xì)胞感染Ad5-VEGFsi后，細(xì)胞凋亡明顯增加，生存力降低，增殖受到抑制。VEGF在細(xì)胞內(nèi)的過度表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞具有抵抗細(xì)胞凋亡及惡性增殖的能力。 （4）隨著VEGF表