烏蘇烷三萜類化合物RA對K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其逆轉(zhuǎn)K562-ADM細(xì)胞耐藥的研究.pdf

1、目的：
　　烏蘇烷三萜類化合物3β,19α-二羥基烏蘇-12-烯-23,28-二羧酸（ Rotundioic acid, RA）是從山綠茶提取的一種烏蘇酸的衍生物，本實驗觀察RA對人紅白血病K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其機制；研究RA對耐阿霉素的K562細(xì)胞（K562/ADM細(xì)胞）增殖活性及抗腫瘤藥物敏感性的影響，并探討RA對K562/ADM細(xì)胞多藥耐藥作用的影響及機制，進(jìn)一步探討RA在白血病的發(fā)生、發(fā)展及耐藥之間的關(guān)聯(lián)，

2、RA有望成為治療白血病的藥物。
　　方法：
　　采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測RA對K562細(xì)胞及K562/ADM細(xì)胞的增殖抑制作用及抗腫瘤藥物敏感性的影響；流式細(xì)胞儀用Annexin V-FITC/PI雙染色法研究RA對K562細(xì)胞凋亡的作用；實時定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)和western blot分別在mRNA和蛋

3、白水平對K562細(xì)胞中PARP、Bcl-2、Bax、NF-кB p65、caspase-3的表達(dá)進(jìn)行檢測；RT-qPCR和western blot檢測K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞MDR1 mRNA和蛋白水平，并檢測非細(xì)胞毒性濃度RA對K562/ADM細(xì)胞MDR1 mRNA及P-gp表達(dá)的影響；Western blot檢測K562/ADM細(xì)胞p-JNK、p-p38、p-ERK1/2的表達(dá)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism

4、6和SPSS18.0軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，用x±s表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　RA抑制K562細(xì)胞的增殖，呈濃度和時間依賴性，在30μg/ml時增殖抑制作用最明顯，24h的IC50為14.94μg/ml；Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測顯示RA誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，呈濃度和時間依賴性，與對照組比較，總凋亡率在高濃度組表現(xiàn)出明顯差異（P<

5、0.01）。RT-qPCR和western blot顯示：RA上調(diào)K562細(xì)胞Bax、caspase-3、PARP的mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時降低Bcl-2、NF-кB p65的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。
　　CCK-8結(jié)果顯示RA抑制K562/ADM細(xì)胞增殖，呈濃度和時間依賴性；K562/ADM細(xì)胞對RA的24h IC50為45.14μg/ml，24h IC10為6.392μg/ml，取4μg/ml為后續(xù)實驗濃度；RA增加K562/AD

6、M細(xì)胞對阿霉素的敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.61倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），對K562細(xì)胞無明顯增敏作用；K562/ADM對ADM的耐藥倍數(shù)為41.76倍。
　　RT-qPCR和western blot顯示：K562細(xì)胞內(nèi)MDR1 mRNA表達(dá)極低水平，其蛋白產(chǎn)物P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）幾乎不表達(dá)；K562/ADM細(xì)胞MDR1 mRNA及P-gp高度表達(dá)；且RA下調(diào)K562/ADM細(xì)胞MDR1的表

7、達(dá)水平。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：RA上調(diào)K562/ADM細(xì)胞p38、ERK1/2的磷酸化水平，不影響p-JNK的表達(dá)，提示RA可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平參與逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥作用。
　　結(jié)論：
　　RA對K562細(xì)胞起增殖抑制及促凋亡作用，呈濃度和時間依賴性，其作用可能與上調(diào)促凋亡基因（PARP、caspase-3、Bax）的表達(dá)及下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)相關(guān)，另外可能與降低NF