2-甲氧基雌二醇對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡及粘附功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是起源于造血干細(xì)胞的克隆增殖性惡性血液病，90％以上CML患者出現(xiàn)9號(hào)和22號(hào)染色體易位形成Ph染色體和bcr/abl融合基因，此基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄合成具有高度酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白，干擾造血干/祖細(xì)胞發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，它是CML Ph 染色體陽性細(xì)胞逃避正常細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控系統(tǒng)，不斷增殖并產(chǎn)生凋亡耐受及大量進(jìn)入外周血的根本原因。CML 的

2、主要特征為細(xì)胞過度增殖、凋亡受抑、粘附及遷移功能異常。 2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2-ME) 為內(nèi)源性雌激素代謝產(chǎn)物，2-ME對(duì)雌激素受體的親和力較低，因此似乎并不是通過影響雌激素受體通路而起作用。2-ME抗腫瘤作用主要是通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯、抗血管新生及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性而實(shí)現(xiàn)的。由于該藥只對(duì)增殖活躍的細(xì)胞有作用，而對(duì)靜止細(xì)胞無作用，因而不良反應(yīng)較小，

3、故近年來日益受到重視。迄今為止，尚無2-ME對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及粘附功能影響的研究報(bào)道，國(guó)外僅有2-ME對(duì)CML細(xì)胞生物學(xué)影響的零星報(bào)道，但無2-ME對(duì)CML細(xì)胞L-選擇素及bcr/abl基因表達(dá)影響的報(bào)道，我們采用新型抗腫瘤化合物2-ME體外研究對(duì)bcr/albl(+)CML急變期細(xì)胞系K562細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及粘附功能的影響，并探討其作用機(jī)制，為2-ME的臨床應(yīng)用提供某些實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)而為CML的靶向治療開辟一條

4、新途徑。 本研究分為如下四個(gè)部分。 第一部分 2-甲氧基雌二醇對(duì)K562細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響 目的：研究2-ME對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。 方法：(1)實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞隨機(jī)分為二組：①對(duì)照組：培養(yǎng)基中不含2-ME；②實(shí)驗(yàn)組：分別用1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L及16μmol/L濃度的2-ME處理K562細(xì)胞24h、36

5、h、48h及60h后觀察各項(xiàng)指標(biāo)的變化。(2)細(xì)胞形態(tài)觀察：倒置相差顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)變化，于2-ME作用36h、形態(tài)學(xué)變化最顯著時(shí)拍攝記錄細(xì)胞形態(tài)。(3)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定2一ME對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。(4)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)2-ME對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響。 結(jié)果：(1)細(xì)胞形態(tài)變化：2-MElμmol/L濃度組整個(gè)時(shí)間段細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；2μmol/L，濃度組于36h可見少許細(xì)胞變形、壞死

6、，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)變形、壞死的細(xì)胞有增多趨勢(shì)；4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L濃度組24h即可見細(xì)胞變形、核固縮、核碎裂和胞膜突起等現(xiàn)象，這種變化與2-ME濃度及時(shí)間呈正相關(guān)趨勢(shì)。(2)2-ME對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響：2-ME對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率各組之間均有顯著性差異(P<0.01)。2．ME在1μmol/L～8μmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨濃度增高而逐漸增加，至16μmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制率

7、增加不明顯；在24h～48h時(shí)間范圍內(nèi)，2-ME對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，至60h時(shí)細(xì)胞抑制率無明顯增加，提示在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，2-ME以時(shí)間-劑量依賴的方式抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。(3)2-ME對(duì)K562細(xì)胞周期的影響：在一定濃度范圍(O～4μmol/L)內(nèi)，隨著2-ME濃度的增加，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞逐漸增多，S期細(xì)胞逐漸減少，但2-ME濃度>4μmol/L后G<,0>/G<,1>期細(xì)胞比例不再增加。2-M

8、E濃度為4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L三組的G<,0>/G<,1>期細(xì)胞比例與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：2-ME在一定的濃度和作用時(shí)間范圍內(nèi)，以劑量-時(shí)間依賴形式抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)變形、核聚集、核碎裂和胞膜突起等形態(tài)改變。隨著2-ME濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，處于G<,0>/G<,1>期的K562細(xì)胞比例逐漸增加，S期細(xì)胞逐漸減少?？傊?-ME在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間和劑量依賴性抑制

9、K562細(xì)胞增殖、阻滯K562細(xì)胞周期異常運(yùn)行。 第二部分 2-甲氧基雌二醇對(duì)K562細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響 目的：研究2-ME對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響，并從凋亡相關(guān)分子Caspase-3和XIAP的mRNA及其蛋白的水平探討2-ME誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的某些機(jī)制。 方法：(1)原位細(xì)胞凋亡法(TUNEL)檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡率。(2)FCM檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡率。(3)FCM檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡

10、相關(guān)分子Caspase-3及XIAP蛋白表達(dá)。(4)半定量 RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞Caspase-3及XIAP基因的表達(dá)。(5)黃嘌吟氧化酶法檢測(cè)K562細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)及活性氧(ROS)水平。 結(jié)果：(1)K562細(xì)胞凋亡率：實(shí)驗(yàn)組經(jīng)K562細(xì)胞與2-ME 分別處理36h后，應(yīng)用TUNEL法染色，顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多。計(jì)算凋亡率結(jié)果顯示，2-ME濃度為1μmol/L 時(shí)，凋亡率未見明顯增加，之

11、后隨著2-ME濃度增加，K562 細(xì)胞凋亡率逐漸增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2-ME濃度至16μmol/L 時(shí)，細(xì)胞凋亡率有所下降；應(yīng)用FCM檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡率，得到相似結(jié)果。兩種方法測(cè)得的K562細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(γ=0.845,P=0.034)。(2)FCM檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：隨著2-ME濃度增加，Caspase-3 蛋白表達(dá)逐漸增加，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05)；而隨著2-

12、ME濃度增加，XIAP蛋白表達(dá)逐漸降低，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)半定量RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)：隨著2-ME濃度增加，Caspase-3基因表達(dá)逐漸增加，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而隨著2-ME濃度增加，XIAP基因表達(dá)逐漸降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Caspase-3與XIAP基因表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.966,P=0.000)。(4

13、)2-ME對(duì)K562細(xì)胞SOD與ROS的影響：隨著2-ME濃度增加，SOD活性逐漸降低，ROS活性逐漸增加，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SOD與ROS水平之間呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.462，P=0.054)。 結(jié)論：(1)2-ME在一定的濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴形式誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。(2)2-ME通過上調(diào)促凋亡基因caspase-3和(或)下調(diào)抗凋亡基因XIAP的表達(dá)、抑制SOD及增加ROS水平等途徑促進(jìn)K56

14、2細(xì)胞凋亡，這可能是2-ME誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。 第三部分 2-甲氧基雌二醇對(duì)K562細(xì)胞L-選擇素及其基因表達(dá)的影響 目的：檢測(cè)2-ME 對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞L-選擇素及其基因表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法：(1)FCM檢測(cè)K562細(xì)胞L-選擇素蛋白表達(dá)。(2)半定量RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞L-選擇素基因表達(dá)。 結(jié)果：(1)2-ME對(duì)K562細(xì)胞L-選擇素蛋白表達(dá)的

15、影響：FCM定量檢測(cè)不同濃度2-ME與K562細(xì)胞作用36h后L-選擇素蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，隨著2-ME濃度增加，L-選擇素蛋白表達(dá)量逐漸增加，2-ME濃度為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L四組L-選擇素蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)2-ME對(duì)K562細(xì)胞L-選擇素基因表達(dá)的影響：應(yīng)用半定量RT-PCR檢測(cè)與不同濃度2-ME作用36h后的K562細(xì)胞L-選擇素基因表達(dá)，結(jié)果表明

16、，隨著2-ME濃度增加，L-選擇素基因表達(dá)量逐漸增加，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：2-ME 能夠增加K562細(xì)胞L-選擇素mRNA及其蛋白表達(dá)，因而改善或恢復(fù)K562細(xì)胞的粘附缺陷。 第四部分 2-甲氧基雌二醇對(duì)K562細(xì)胞bcr/abl融合基因表達(dá)的影響 目的：檢測(cè)2-ME對(duì)白血病K562細(xì)胞bcr/abl mRNA及其蛋白P210表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法：(1)SY

17、BR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞bcr/ablmRNA表達(dá)。(2)Western印跡法檢測(cè)K562細(xì)胞bcr/abl融合蛋白P210表達(dá)。 結(jié)論：2-ME 不影響K562細(xì)胞bcr/abl融合基因mRNA表達(dá)水平，但可降低其bcr/abl融合蛋白水平，并與K562細(xì)胞的凋亡率呈負(fù)相關(guān)，這可能是2-ME誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。 綜上所述，CML 的主要特征為細(xì)胞過度增殖、凋亡受抑及粘附、