2-甲氧基雌二醇對K562細胞增殖、凋亡及粘附功能的影響及其機制研究.pdf

1、慢性粒細胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是起源于造血干細胞的克隆增殖性惡性血液病，90％以上CML患者出現(xiàn)9號和22號染色體易位形成Ph染色體和bcr/abl融合基因，此基因進一步轉(zhuǎn)錄合成具有高度酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白，干擾造血干/祖細胞發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，它是CML Ph 染色體陽性細胞逃避正常細胞增殖和凋亡調(diào)控系統(tǒng)，不斷增殖并產(chǎn)生凋亡耐受及大量進入外周血的根本原因。CML 的

2、主要特征為細胞過度增殖、凋亡受抑、粘附及遷移功能異常。 2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2-ME) 為內(nèi)源性雌激素代謝產(chǎn)物，2-ME對雌激素受體的親和力較低，因此似乎并不是通過影響雌激素受體通路而起作用。2-ME抗腫瘤作用主要是通過抑制細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞凋亡、細胞周期停滯、抗血管新生及增強腫瘤細胞對輻射的敏感性而實現(xiàn)的。由于該藥只對增殖活躍的細胞有作用，而對靜止細胞無作用，因而不良反應(yīng)較小，

3、故近年來日益受到重視。迄今為止，尚無2-ME對白血病細胞增殖、凋亡、細胞周期及粘附功能影響的研究報道，國外僅有2-ME對CML細胞生物學(xué)影響的零星報道，但無2-ME對CML細胞L-選擇素及bcr/abl基因表達影響的報道，我們采用新型抗腫瘤化合物2-ME體外研究對bcr/albl(+)CML急變期細胞系K562細胞增殖、細胞周期、凋亡及粘附功能的影響，并探討其作用機制，為2-ME的臨床應(yīng)用提供某些實驗依據(jù)，進而為CML的靶向治療開辟一條

4、新途徑。 本研究分為如下四個部分。 第一部分 2-甲氧基雌二醇對K562細胞增殖及細胞周期的影響 目的：研究2-ME對慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞增殖及細胞周期的影響。 方法：(1)實驗分組：取對數(shù)生長期的K562細胞隨機分為二組：①對照組：培養(yǎng)基中不含2-ME；②實驗組：分別用1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L及16μmol/L濃度的2-ME處理K562細胞24h、36

5、h、48h及60h后觀察各項指標的變化。(2)細胞形態(tài)觀察：倒置相差顯微鏡下觀察各實驗組細胞形態(tài)變化，于2-ME作用36h、形態(tài)學(xué)變化最顯著時拍攝記錄細胞形態(tài)。(3)四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定2一ME對細胞增殖的抑制作用。(4)流式細胞術(shù)(FCM)檢測2-ME對K562細胞周期分布的影響。 結(jié)果：(1)細胞形態(tài)變化：2-MElμmol/L濃度組整個時間段細胞形態(tài)變化不明顯；2μmol/L，濃度組于36h可見少許細胞變形、壞死

6、，隨著時間的延長變形、壞死的細胞有增多趨勢；4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L濃度組24h即可見細胞變形、核固縮、核碎裂和胞膜突起等現(xiàn)象，這種變化與2-ME濃度及時間呈正相關(guān)趨勢。(2)2-ME對K562細胞增殖的影響：2-ME對K562細胞的生長抑制率各組之間均有顯著性差異(P<0.01)。2．ME在1μmol/L～8μmol/L濃度范圍內(nèi)，對K562細胞的生長抑制率隨濃度增高而逐漸增加，至16μmol/L時，細胞抑制率

7、增加不明顯；在24h～48h時間范圍內(nèi)，2-ME對K562細胞的生長抑制率隨時間延長而逐漸增加，至60h時細胞抑制率無明顯增加，提示在一定濃度和時間范圍內(nèi)，2-ME以時間-劑量依賴的方式抑制細胞生長。(3)2-ME對K562細胞周期的影響：在一定濃度范圍(O～4μmol/L)內(nèi)，隨著2-ME濃度的增加，G<,0>/G<,1>期細胞逐漸增多，S期細胞逐漸減少，但2-ME濃度>4μmol/L后G<,0>/G<,1>期細胞比例不再增加。2-M

8、E濃度為4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L三組的G<,0>/G<,1>期細胞比例與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：2-ME在一定的濃度和作用時間范圍內(nèi)，以劑量-時間依賴形式抑制K562細胞生長，細胞出現(xiàn)變形、核聚集、核碎裂和胞膜突起等形態(tài)改變。隨著2-ME濃度增加和作用時間延長，處于G<,0>/G<,1>期的K562細胞比例逐漸增加，S期細胞逐漸減少?？傊?，2-ME在一定范圍內(nèi)呈時間和劑量依賴性抑制

9、K562細胞增殖、阻滯K562細胞周期異常運行。 第二部分 2-甲氧基雌二醇對K562細胞凋亡及凋亡相關(guān)分子表達的影響 目的：研究2-ME對白血病K562細胞凋亡的影響，并從凋亡相關(guān)分子Caspase-3和XIAP的mRNA及其蛋白的水平探討2-ME誘導(dǎo)K562細胞凋亡的某些機制。 方法：(1)原位細胞凋亡法(TUNEL)檢測K562細胞凋亡率。(2)FCM檢測K562細胞凋亡率。(3)FCM檢測K562細胞凋亡

10、相關(guān)分子Caspase-3及XIAP蛋白表達。(4)半定量 RT-PCR檢測K562細胞Caspase-3及XIAP基因的表達。(5)黃嘌吟氧化酶法檢測K562細胞超氧化物歧化酶(SOD)及活性氧(ROS)水平。 結(jié)果：(1)K562細胞凋亡率：實驗組經(jīng)K562細胞與2-ME 分別處理36h后，應(yīng)用TUNEL法染色，顯微鏡下觀察凋亡細胞較對照組明顯增多。計算凋亡率結(jié)果顯示，2-ME濃度為1μmol/L 時，凋亡率未見明顯增加，之

11、后隨著2-ME濃度增加，K562 細胞凋亡率逐漸增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2-ME濃度至16μmol/L 時，細胞凋亡率有所下降；應(yīng)用FCM檢測K562細胞凋亡率，得到相似結(jié)果。兩種方法測得的K562細胞凋亡率呈正相關(guān)(γ=0.845,P=0.034)。(2)FCM檢測K562細胞凋亡相關(guān)蛋白表達：隨著2-ME濃度增加，Caspase-3 蛋白表達逐漸增加，與對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)；而隨著2-

12、ME濃度增加，XIAP蛋白表達逐漸降低，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(3)半定量RT-PCR檢測K562細胞凋亡相關(guān)基因表達：隨著2-ME濃度增加，Caspase-3基因表達逐漸增加，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而隨著2-ME濃度增加，XIAP基因表達逐漸降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Caspase-3與XIAP基因表達量之間呈負相關(guān)(γ=-0.966,P=0.000)。(4

13、)2-ME對K562細胞SOD與ROS的影響：隨著2-ME濃度增加，SOD活性逐漸降低，ROS活性逐漸增加，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SOD與ROS水平之間呈負相關(guān)(γ=-0.462，P=0.054)。 結(jié)論：(1)2-ME在一定的濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴形式誘導(dǎo)K562細胞凋亡。(2)2-ME通過上調(diào)促凋亡基因caspase-3和(或)下調(diào)抗凋亡基因XIAP的表達、抑制SOD及增加ROS水平等途徑促進K56

14、2細胞凋亡，這可能是2-ME誘導(dǎo)K562細胞凋亡的機制之一。 第三部分 2-甲氧基雌二醇對K562細胞L-選擇素及其基因表達的影響 目的：檢測2-ME 對慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞L-選擇素及其基因表達的影響，并探討其作用機制。 方法：(1)FCM檢測K562細胞L-選擇素蛋白表達。(2)半定量RT-PCR檢測K562細胞L-選擇素基因表達。 結(jié)果：(1)2-ME對K562細胞L-選擇素蛋白表達的

15、影響：FCM定量檢測不同濃度2-ME與K562細胞作用36h后L-選擇素蛋白表達，結(jié)果表明，隨著2-ME濃度增加，L-選擇素蛋白表達量逐漸增加，2-ME濃度為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L四組L-選擇素蛋白表達量與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)2-ME對K562細胞L-選擇素基因表達的影響：應(yīng)用半定量RT-PCR檢測與不同濃度2-ME作用36h后的K562細胞L-選擇素基因表達，結(jié)果表明

16、，隨著2-ME濃度增加，L-選擇素基因表達量逐漸增加，與對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：2-ME 能夠增加K562細胞L-選擇素mRNA及其蛋白表達，因而改善或恢復(fù)K562細胞的粘附缺陷。 第四部分 2-甲氧基雌二醇對K562細胞bcr/abl融合基因表達的影響 目的：檢測2-ME對白血病K562細胞bcr/abl mRNA及其蛋白P210表達的影響，并探討其作用機制。 方法：(1)SY

17、BR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR檢測K562細胞bcr/ablmRNA表達。(2)Western印跡法檢測K562細胞bcr/abl融合蛋白P210表達。 結(jié)論：2-ME 不影響K562細胞bcr/abl融合基因mRNA表達水平，但可降低其bcr/abl融合蛋白水平，并與K562細胞的凋亡率呈負相關(guān)，這可能是2-ME誘導(dǎo)K562細胞凋亡的機制之一。 綜上所述，CML 的主要特征為細胞過度增殖、凋亡受抑及粘附、