α-甘露糖苷酶活性在沙眼衣原體侵染細(xì)胞中的作用及其診斷價值的研究.pdf

1、α-甘露糖苷酶(α-mannosidase)是一種糖苷水解酶，在N-連接糖蛋白的合成和加工中具有重要作用。有關(guān)α-甘露糖苷酶的研究雖然較多，但研究對象主要集中在真核生物，對原核生物特別是病原原核生物的α-甘露糖苷酶研究相對較少。隨著特異性酶顯色技術(shù)逐步發(fā)展，酶顯色技術(shù)用于α-甘露糖苷酶活性測定成為可能。沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）臨床檢測雖然有多種方法，如細(xì)胞培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、生化方法以及分子生物學(xué)方法，但

2、這些方法均存在一些問題，如細(xì)胞培養(yǎng)法和膠體金免疫法的敏感性較低，而且細(xì)胞培養(yǎng)法不易用于臨床，生化方法的特異性不強，分子生物學(xué)方法的操作復(fù)雜及費時較長等，這些問題已嚴(yán)重影響沙眼衣原體感染的臨床檢測。隨著顯色培養(yǎng)基技術(shù)和酶顯色技術(shù)的發(fā)展，酶法快速檢測微生物已成為目前臨床微生物檢測的一個方向。泌尿生殖道常見病原微生物以及沙眼衣原體多數(shù)流行株是否有僻甘露糖苷酶以及酶活性如何，將決定靜甘露糖苷酶活性對沙眼衣原體臨床檢測是否有潛在的診斷價值。如果α

3、-甘露糖苷酶活性可以作為診斷標(biāo)志物，那么沙眼衣原體α-甘露糖苷酶的分離提純、α-甘露糖苷酶活性對沙眼衣原體侵染細(xì)胞是否有影響、這種影響是否有特異性以及以此建立弘甘露糖苷酶活性診斷沙眼衣原體感染方法的性能和能否產(chǎn)品化等問題都值得深入研究。為了詳細(xì)研究這些問題，本論文共分為以下三個部分來闡明洳甘露糖苷酶活性在沙眼衣原體侵染細(xì)胞中的作用及其診斷價值。
　　第一部分泌尿生殖道常見微生物α-甘露糖苷酶活性研究
　　目的:
　　研

4、究泌尿生殖道常見微生物在α-甘露糖苷酶活性快速檢測中所表現(xiàn)活力，以期確定α-甘露糖苷酶活性對臨床沙眼衣原體感染是否有快速診斷價值。
　　方法:
　　1.以泌尿生殖道常見的微生物包括18種細(xì)菌、7種念珠菌、2種支原體和1種原蟲共計28株標(biāo)準(zhǔn)菌株和40株臨床分離菌株以及2株沙眼衣原體不同血清型標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行培養(yǎng)。
　　2.把培養(yǎng)所得的各種微生物分別以離心洗滌和不洗滌的方式收集培養(yǎng)物。
　　3.沙眼衣原體和化膿性鏈球菌(S

5、treptococcus pyogenes)分別以超聲波細(xì)胞破碎和不破碎的方式收集培養(yǎng)物，白色念珠菌(Candida albicans)分別以冷凍研磨破碎和不破碎的方式收集培養(yǎng)物。
　　4.分別以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷和6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為α-甘露糖苷酶顯色底物，測定各種培養(yǎng)物在37℃不同反應(yīng)時間(10、30和60min)的570 nm和512nm吸光度。
　　結(jié)果:
　　1.沙眼

6、衣原體血清型D株對HeLa229細(xì)胞侵染率（被侵染的細(xì)胞占視野內(nèi)所有細(xì)胞的比率）(18.75％、24.06％和17.65％)低于沙眼衣原體血清型E株對HeLa229細(xì)胞侵染率(59.69％、62.96％和53.85％)。經(jīng)卡方檢驗，兩者侵染率概率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=16.273，P＜0.05）。
　　2.以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷和6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為α-甘露糖苷酶顯色底物，沙眼衣原體

7、血清型D株和E株所呈現(xiàn)的α-甘露糖苷酶活性均明顯高于其他微生物的，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，α-甘露糖苷酶活性對臨床沙眼衣原體感染有快速診斷價值。陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)和部分念珠菌也表現(xiàn)微弱的α-甘露糖苷酶活性，吸光度達(dá)到0.150～0.250。
　　3.對各種微生物培養(yǎng)收集物在不同條件下分別得到的OD570和OD512應(yīng)用重復(fù)測量資料的方差分析方法，發(fā)現(xiàn)不同的顯色底物(F=103.25

8、1，P＜0.05)、洗滌與否(F=88.253，P＜0.05)及顯色時間(F=213.235，P＜0.05)均對檢測結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為酶底物顯色慢而且淺（未破碎的沙眼衣原體血清型D株10、30和60 min OD570分別為0.159、0.221和389，未破碎的沙眼衣原體血清型E株10、30和60 min OD570分別為0.147、0.198和0.358），兩株血清型O

9、D570的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.605，P＞0.05)。而以6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為酶底物顯色相對快而且深（未破碎的沙眼衣原體血清型D株10、30和60 min OD512分別為0.519、0.607和1.826，未破碎的沙眼衣原體血清型E株10、30和60 min OD512分別為0.588、0.957和2.025），兩株血清型OD512的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.845，P＞0.05)。
　　第二部分沙眼衣

10、原體α-甘露糖苷酶分離純化及酶活性對沙眼衣原體侵染細(xì)胞的影響
　　目的:
　　研究沙眼衣原體α-甘露糖苷酶分離純化方法和α-甘露糖苷酶活性對沙眼農(nóng)原體侵染細(xì)胞的影響及這種影響的特異性。
　　方法:
　　1.破碎的沙眼衣原體血清型D株細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)過離心、超聲波破碎、硫酸銨分級沉淀及SephadexG-100柱層析純化分離純化α-甘露糖苷酶，純化后的α-甘露糖苷酶采用SDS-PAGE鑒定酶純度并測定酶的分子量。

11、>　　2.純化的α-甘露糖苷酶免疫兔子制備抗α-甘露糖苷酶血清，抗血清經(jīng)硫酸銨沉淀及Sepharose CL-4B親和層析純化后，采用免疫雙擴散測定純化抗α-甘露糖苷酶多抗效價。
　　3.純化的α-甘露糖苷酶、抗α-甘露糖苷酶多抗及刀豆源的α-甘露糖苷酶分別以三種濃度（0.02、0.1和0.5 mg蛋白/ml培養(yǎng)基）加入DEAE-葡聚糖溶液處理過的HeLa229單層細(xì)胞，然后接種沙眼衣原體血清型D株，培養(yǎng)后直接免疫熒光染色鏡檢觀察

12、沙眼衣原體侵染率的差異，不加α-甘露糖苷酶和抗α-甘露糖苷酶多抗的沙眼衣原體血清型D株侵染培養(yǎng)物作為對照。
　　結(jié)果:
　　1.SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)純化的沙眼衣原體血清型D株α-甘露糖苷酶電泳只有一條蛋白條帶，分子量約為50kDa。
　　2.抗α-甘露糖苷酶血清抗體滴度為1/64，純化后，抗α-甘露糖苷酶多抗滴度也為1/64。
　　3.加入純化抗α-甘露糖苷酶多抗的沙眼衣原體血清型D株的侵染率與對照的侵染率總

13、體概率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=137.062，P＜0.05)，而且具有隨添加濃度升高而降低的趨勢(x2=65.328，P＜0.05)。加入純化α-甘露糖苷酶的沙眼衣原體血清型D株侵染率與對照的侵染率總體概率分布差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=117.539，P＜0.05)，而且具有隨添加濃度升高而升高的趨勢(x2=98.227，P＜0.05)。而加入刀豆源的α-甘露糖苷酶的沙眼衣原體血清型D株的侵染率與對照的侵染率總體概率分布差異不具

14、有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=0.096，P＞0.05)。
　　第三部沙眼衣原體α-甘露糖苷酶活性檢測方法的建立及臨床評價
　　目的:
　　以6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為酶顯色底物，建立適合臨床需要且能夠產(chǎn)品化的酶法沙眼衣原體檢測方法，評價其各項性能，為沙眼衣原體臨床診療服務(wù)。
　　方法:
　　1.以基本檢測體系為基礎(chǔ)，對影響配方的各因素先進(jìn)行單因素多水平試驗及分析，再據(jù)此進(jìn)行四因素三水平正交設(shè)計與直觀分析

15、，經(jīng)正交驗證并結(jié)合反應(yīng)時間的調(diào)整等篩選出最佳配方，判斷的出發(fā)點是下面公式中的“M”值越大越好。M=(AD+AE-B-C)/2
　　其中M為陽性結(jié)果OD512與干擾結(jié)果OD512的差值，AD為沙眼衣原體血清型D株培養(yǎng)物酶法檢測OD512的值，AE為沙眼衣原體血清型E株培養(yǎng)物酶法檢測OD512的值，B為兩株白色念珠菌培養(yǎng)物酶法檢測OD512的均值，C為兩株化膿性鏈球菌培養(yǎng)物酶法檢測OD512的均值。
　　2.確定所建立的酶法沙眼

16、衣原體檢測限(LOD)和酶檢測限，并用尿道分泌物、宮頸分泌物、陰道分泌物、前列腺按摩液及精液標(biāo)本等多種共計665例臨床標(biāo)本初步評估陽性率，以確定進(jìn)行臨床性能評估的標(biāo)本類型。
　　3.用尿道分泌物、宮頸分泌物、陰道分泌物及前列腺按摩液等多種共計553例臨床標(biāo)本評估所建立的酶法臨床性能，與細(xì)胞培養(yǎng)法及連接酶鏈反應(yīng)法(LCR)對比，參比方法采用“擴大的金標(biāo)準(zhǔn)”即細(xì)胞培養(yǎng)和LCR兩種方法檢測結(jié)果中有一個陽性即為真陽性，而不論酶法結(jié)果如何。

17、
　　4.確定所建立的酶法及質(zhì)控參考品有效期。
　　結(jié)果:
　　1.正交分析固紫B鹽濃度影響最大，而0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH則影響最小。但正交驗證發(fā)現(xiàn)正交表中的實驗6所采用的配方優(yōu)于直觀分析的最佳水平組合，考慮檢測時間的臨床價值以及在此基礎(chǔ)上TritonⅩ-100濃度的影響，在37℃孵育15 min的反應(yīng)條件下，篩選最佳配方為:顯色劑為2 mg/ml6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷溶液，溶劑為含0

18、.75％(v/v) TritonⅩ-100的0.1 mol/L、pH4.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;固紫B鹽溶液濃度為1.5 mg/ml，溶劑為生理鹽水;樣品稀釋液為不含底物的顯色劑。
　　2.酶法沙眼衣原體檢測限和酶檢測限分別是617 IFU/ml和10-3 u/ml，尿道分泌物、宮頸分泌物、陰道分泌物、前列腺按摩液和精液標(biāo)本的陽性率分別是11.11％、12.74％、9.91％、27.27％和93.33％，說明精液對酶法有干擾，前

19、列腺按摩液也可能有干擾。
　　3.前列腺按摩液有干擾，但排除前列腺按摩液標(biāo)本后，酶法檢測沙眼衣原體靈敏度和特異性分別是91.8％(95％CI，86.0％～97.6％)和98.3％(95％CI，97.1％～99.5％)，與擴大的金標(biāo)準(zhǔn)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.α-甘露糖苷酶法檢測體系產(chǎn)品2℃～8℃貯存有效期為23個月，質(zhì)控參考品-20℃貯存有效期為5.5個月。
　　結(jié)論:
　　1.α-甘露糖