條件性基因敲除鼠肺腺癌干細(xì)胞的分離、鑒定及其microRNA表達(dá)譜的初步研究.pdf

1、肺癌是威脅人類健康的最常見惡性腫瘤。目前,肺癌早期診斷技術(shù)的提高和以手術(shù)、化療和放療為主的綜合治療方法取得了較大的進(jìn)步,但肺癌總的5年生存率仍不足15％。近年來的研究表明,腫瘤是一種干細(xì)胞疾病,在腫瘤組織中存在少量癌干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞是一群稀少的未分化的腫瘤細(xì)胞,具有無限增殖和自我更新的能力,能夠產(chǎn)生大量分化細(xì)胞的前體細(xì)胞,最終形成腫瘤?，F(xiàn)已經(jīng)從多種腫瘤組織中成功分離出癌干細(xì)胞,包括白血病、黑素瘤、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和腸

2、癌等。這些細(xì)胞具有無限的增殖能力、自我更新能力和分化能力,是腫瘤發(fā)生的根源。因此,探索癌干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制和尋找癌干細(xì)胞特異性分子,將為腫瘤的診斷和治療提供有效的靶點。
　　 為了驗證肺腺癌干細(xì)胞及其特征性miRNAs在肺腺癌發(fā)生中的重要作用,我們擬從肺腺癌干細(xì)胞入手,首先,建立條件性基因敲除小鼠肺腺癌模型;流式細(xì)胞儀分選肺腺癌干細(xì)胞;肺腺癌干細(xì)胞的培養(yǎng)以及鑒定;微陣列技術(shù)檢測在肺腺癌形成過程的不同時期肺癌干細(xì)胞miRNAs表達(dá)情

3、況,并應(yīng)用實時定量熒光PCR技術(shù)(quantitativereal-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)進(jìn)行驗證:生物信息學(xué)初步預(yù)測所選miRNAs的功能及其作用靶點。本研究以小鼠肺腺癌干細(xì)胞的分離、鑒定為基礎(chǔ),以尋找在小鼠肺腺癌形成過程中肺腺癌干細(xì)胞的特征性miRNAs為突破點,研究小鼠正常肺干細(xì)胞惡性突變?yōu)榉蜗侔└杉?xì)胞的分子機(jī)制,不僅鑒定了正常小鼠肺干細(xì)胞向肺腺癌干細(xì)胞突變過程中的miRNA

4、s表達(dá)譜,而且為后續(xù)深入探討miRNAs調(diào)控干細(xì)胞自我更新和分化作用以及肺干細(xì)胞向肺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 腺病毒AdCre的大量擴(kuò)增后,腺病毒AdCre誘導(dǎo)條件性基因敲除鼠Lox-stop-loxK-ras G12D小鼠肺腺癌模型的建立;根據(jù)表面標(biāo)記肺干細(xì)胞的CD45-CD3rSca-1+CD34+流式細(xì)胞儀分選出腺病毒AdCre誘導(dǎo)后Lox-stop-lox K-rasG12D小鼠肺腺

5、癌模型中的陽性細(xì)胞,并驗證其是否具有癌干細(xì)胞特性;微陣列技術(shù)檢測BASCs和肺腺癌模型中CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞的miRNAs表達(dá)情況,比較二者miRNAs表達(dá)差異,并應(yīng)用實時定量熒光PCR技術(shù)(quantitative real-timepolymerase chain reaction,qRT-PCR)進(jìn)行驗證:生物信息學(xué)初步預(yù)測所選miRNAs的功能及其作用靶點。生物信息學(xué)初步預(yù)測let-7a-2的相關(guān)靶基因

6、,Lenti-1et-7a-2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,以腫瘤qRT-PCR凋亡相關(guān)芯片尋找Lenti-let-7a-2改變的凋亡相關(guān)基因。
　　 方法:
　　 1.Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌模型的建立:腺病毒AdCre的大量擴(kuò)增后,以戊巴比妥鈉腹腔麻醉Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠后,分別于鼻腔吸入腺病毒AdCre后15天、30天后,取小鼠全部肺組織進(jìn)行病理切片檢測肺部腫瘤細(xì)胞

7、的生長情況。
　　 2.小鼠肺腺癌干細(xì)胞的分選和培養(yǎng)鑒定:取腺病毒AdCre誘導(dǎo)不同時期的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠全肺組織。采用膠原酶和分散酶聯(lián)合消化小鼠肺組織制備肺單細(xì)胞懸液,通過流式細(xì)胞儀分選CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞,并將其培養(yǎng)于含有bFGF、EGF和ITS的無血清培養(yǎng)基,體外培養(yǎng)檢測CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞自我更新能力、分化能力,體內(nèi)成瘤實驗檢測其致瘤能

8、力。
　　 3.Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌不同時期miRNAs表達(dá)譜的鑒定:經(jīng)腺病毒AdCre誘導(dǎo)15天、30天的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠全部肺部組織分別制備為單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,分選出的細(xì)胞常規(guī)提取RNA后,經(jīng)YM-100(Millipore)微離心過濾柱抽提小于300核苷酸長度的小RNA;微陣列法檢測肺腺癌形成的過程中不同時期肺腺癌干細(xì)胞和其對照細(xì)胞(未經(jīng)腺

9、病毒AdCre誘導(dǎo)的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺干細(xì)胞)的miRNAs表達(dá)譜,篩選出差異miRNAs;構(gòu)建miRNAs特異性探針,qRT-PCR法驗證所選差異miRNAs在兩種細(xì)胞的表達(dá);生物信息學(xué)初步預(yù)測被選miRNAs的功能及其作用靶點。
　　 4.將Lenti-let-7a-2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lenti-let-7a-2的A549細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染Lenti-let-7a-2的A549細(xì)胞進(jìn)

10、行qRT-PCR凋亡相關(guān)芯片檢測,結(jié)合生物信息學(xué)的靶基因預(yù)測,篩選出let-7a-2與腫瘤凋亡相關(guān)的基因變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌模型:腺病毒AdCre擴(kuò)增、滴度測定后,給Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠鼻腔吸入腺病毒AdCre后分別15天后,小鼠肺組織外觀未見改變,但顯微環(huán)境下支氣管、細(xì)支氣管粘膜變厚,粘膜下層有異型性細(xì)胞聚集;30

11、天后小鼠肺組織表面許多突起的瘤體組織,小鼠全部肺組織都不同程度呈現(xiàn)癌變,肺組織可見多處癌巢。
　　 2.流式細(xì)胞儀分選小鼠肺腺癌模型中的CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞,在體外無血清培養(yǎng)體系中,CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞可以生長為非貼壁的、多細(xì)胞的細(xì)胞球。在含有血清的培養(yǎng)基中,CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞可以分化為其他細(xì)胞。體內(nèi)的成瘤實驗表明,CD45-CD31-Sca-1+C

12、D34+細(xì)胞的致瘤能力是肺腺癌模型肺組織單細(xì)胞的25倍以上。以上均說明小鼠肺腺癌動物模型中的CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞具有癌干細(xì)胞的特性。
　　 3.肺腺癌形成過程中不同時期(腺病毒AdCre誘導(dǎo)前、腺病毒AdCre誘導(dǎo)后15天、腺病毒AdCre誘導(dǎo)后30天)CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞的分選及其miRNAs表達(dá)譜差異:通過膠原酶和分散酶聯(lián)合消化小鼠肺組織,平均每只成年小鼠可得到有核細(xì)胞總數(shù)

13、為1.6～1.8×107;流式細(xì)胞儀檢測CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞占肺細(xì)胞總數(shù)的0.7％～1.1％。微陣列法檢測miRNAs的表達(dá)并比較差異,背景值經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后,比較三組細(xì)胞共發(fā)現(xiàn)依次增高的microRNA分子有145個、依次降低的microRNA分子有72個(P＜0.01);其中有13個miRNAs在腺病毒AdCre誘導(dǎo)后的動物模型中高表達(dá),67個miRNAs在腺病毒AdCre誘導(dǎo)后的動物模型中低表達(dá);三組樣本之間

14、有依次遞增或者遞減的分子,特別是他們之間差異巨大的分子,根據(jù)對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,mmu-miR-15a*、mmu-miR-203、mmu-miR-294、mmu-miR-295*在三組樣本中依次遞增約1.2倍;mmu-miR-19b、mmu-miR-483、mmu-miR-615-5p依次遞減約0.5倍。通過qRT-PCR法檢測這7個分子在三個不同樣本中的差異,RT-PCR的檢測結(jié)果與miRNAs芯片檢測結(jié)果一致。生物信息學(xué)初步分析所選差

15、異miRNAs的作用靶點和功能。
　　 4.通過targetscn及pictar在線軟件生物信息學(xué)分析,let-7a定位于11號染色體的122017230-122017301[-],通過預(yù)測let-7a的保守性靶點為HMGA2等819個分子,其中包括FASLG;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lenti-let-7a-2的A549細(xì)胞腫瘤qRT-PCR凋亡相關(guān)芯片與未轉(zhuǎn)染Lenti-let-7a-2的A549細(xì)胞比較提示BCLAF1等14分子的2^-△

16、Ct值增高,BCL2A1、FASLG、TNF等16個分子的2^-△Ct值降低;作為穩(wěn)定表達(dá)let-7a分子的A549,更關(guān)心芯片中表達(dá)降低的分子,結(jié)合生物信息學(xué)分析,確定表達(dá)降低分子中FASLG為let-7a的靶分子。
　　 結(jié)論
　　 1.成功建立Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠肺腺癌模型。在條件性基因敲除小鼠肺腺癌動物模型鼠中,CD45-CD31-Sea-1+CD34+細(xì)胞具有癌干細(xì)胞的特性。

17、>　　 2.通過微陣列法鑒定了肺腺癌形成過程中不同時期CD45-CD31-Sca-1+CD34+細(xì)胞的miRNAs譜,通過對比發(fā)現(xiàn)其中有13個miRNAs在腺病毒AdCre誘導(dǎo)后的動物模型中高表達(dá),67個miRNAs在腺病毒AdCre誘導(dǎo)后的動物模型中低表達(dá),mmu-miR-15a*、mmu-miR-203、mmu-miR-294、mmu-miR-295*在三組樣本中依次遞增約1.2倍,mmu-miR-19b、mmu-miR-483、