印跡基因H19對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)分子的研究.pdf

1、背景與目的： 滋養(yǎng)細(xì)胞來源于形成中胚泡的滋養(yǎng)內(nèi)胚層，是胚泡中最先分化的細(xì)胞。滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和程序性侵入是胚胎發(fā)育、胎盤形成及胎兒生長所必需的。滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異?？蓪?dǎo)致子癇前期/子癇、不明原因的流產(chǎn)、胎兒生長受限等妊娠相關(guān)性疾病以及葡萄胎、侵襲性葡萄胎、絨癌等妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(Gestational trophoblasticdiseases，GTD)的發(fā)生。因而，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制的深入研究，有利于闡明妊娠相關(guān)

2、性疾病以及妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)病機(jī)制，并對(duì)這些疾病的防治有重要的意義。 研究滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和程序性侵襲行為的調(diào)控因素已成為目前婦產(chǎn)科學(xué)研究熱點(diǎn)，但確切的調(diào)控機(jī)制至今尚未闡明。調(diào)控因素很多，也很復(fù)雜。如何將這些錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控因素有機(jī)地統(tǒng)一起來一直是困擾我們的難題。但不管通過何種因素起作用，其最初都是先出現(xiàn)某個(gè)基因或某組基因的改變，最終通過細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑來引起滋養(yǎng)細(xì)胞功能的變化。 基因印跡(gene imprin

3、ting)是指體細(xì)胞來源于不同親代的一對(duì)等位基因發(fā)生的差異性表達(dá)，它是一種不遵從經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律的依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)性狀的現(xiàn)象。正常的基因印跡在功能上與胎兒及胎盤的發(fā)育、細(xì)胞分化和增殖等有關(guān)。基因印跡異常(如印跡丟失、雜合性丟失、單親二倍體等現(xiàn)象)與某些特殊的遺傳性疾病及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。其中印跡基因H19作為最早發(fā)現(xiàn)的印跡基因之一，是一種母系表達(dá)，父系沉默的印跡基因，又是一種非編碼RNA，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不編碼蛋白，而是在RNA水

4、平發(fā)揮作用。但H19確切的作用機(jī)制目前仍未能完全闡明。有學(xué)者認(rèn)為它是原癌基因，也有學(xué)者認(rèn)為它是抑癌基因。因此，H19可能在細(xì)胞的增殖、分化和侵襲方面具有雙重作用。印跡基因H19的不同作用取決于不同的組織類型以及不同的發(fā)育階段，即H19基因具有組織特異性及發(fā)育階段特異性。然而，目前的文獻(xiàn)報(bào)道仍然無法明確在滋養(yǎng)細(xì)胞中H19到底是抑癌基因還是原癌基因。我們既往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)H19的印跡狀態(tài)在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)育過程中存在著動(dòng)態(tài)變化，而這個(gè)動(dòng)態(tài)變

5、化的節(jié)點(diǎn)是在孕10周，恰好和滋養(yǎng)細(xì)胞的第一次侵襲高峰的時(shí)間非常一致。因此，我們有理由推測：印跡基因H19在滋養(yǎng)細(xì)胞節(jié)制性侵襲行為(或程序性侵襲行為)的調(diào)控中可能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。 我們既往的研究發(fā)現(xiàn)H19在45％的子癇前期胎盤組織中呈印跡丟失(Loss ofimprinting，LOI)，在正常晚孕胎盤組織中均呈印跡狀態(tài)；然而在子癇前期胎盤組織中H19 RNA表達(dá)水平與正常晚孕胎盤組織卻無差異。H19的印跡狀態(tài)與H19 RNA

6、表達(dá)水平的不一致也在很多腫瘤組織的研究中被認(rèn)識(shí)到。H19的表達(dá)水平除了印跡或甲基化的調(diào)控方式外，可能還存在著其他的調(diào)控方式或者負(fù)反饋的保護(hù)作用。那么，H19到底是通過印跡狀態(tài)的改變起作用還是通過RNA表達(dá)水平的變化起決定性作用，或者是兩種方式均產(chǎn)生作用，目前仍不清楚。我們之前采用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5一雜氮脫氧胞苷作用于人滋養(yǎng)細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，H19啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，H19 RNA表達(dá)明顯上調(diào)，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移

7、和侵襲能力下降。雖然前期的實(shí)驗(yàn)可以證明H19啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的高低可直接影響H19的表達(dá)水平，但是由于5-雜氮脫氧胞苷的甲基化抑制效應(yīng)是廣譜的，而缺乏特異性，因此，藥物作用不僅引起H19基因的表達(dá)改變，還可能影響其它基因的印跡狀態(tài)和表達(dá)水平。目前尚沒有針對(duì)H19的甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的藥物。因此，為了進(jìn)一步闡明或明確H19的表達(dá)水平對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響，本研究擬通過人全長H19cDNA重組真核表達(dá)載體和H19-RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)

8、建來深入探討H19過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響；同時(shí)探討H19通過哪些相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)分子來影響滋養(yǎng)細(xì)胞的功能以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)分子在重度子癇前期胎盤組織中的表達(dá)狀況，為印跡基因H19調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能改變的分子機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)，為子癇前期的發(fā)病機(jī)制的闡明提供新的線索。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.滋養(yǎng)細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞和JAR細(xì)胞以及正常胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞H19的表達(dá)水平非常豐富，而且H19-RNA干擾慢病毒載體感

9、染后不影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，因此，采用H19-RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建H19低表達(dá)模型的方法優(yōu)于含人全長H19cDNA重組真核表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV的H19過表達(dá)模型，更適合用于H19在滋養(yǎng)細(xì)胞中的功能研究。H19-RNA干擾慢病毒載體的成功構(gòu)建，為后續(xù)的H19的功能研究奠定了基礎(chǔ)。 2.H19干擾后可抑制JAR細(xì)胞的凋亡，使JAR細(xì)胞周期阻滯在G1期，而不影響JAR細(xì)胞侵襲力以及細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metall

10、oproteinase-9，MMP-9)mRNA的表達(dá)，提示H19不是直接通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，而是通過參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和凋亡過程來影響滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能。 3.分別采用含人全長H19cDNA重組真核表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV轉(zhuǎn)染的方法和H19RNA干擾的方法均證實(shí)了在人絨癌滋養(yǎng)細(xì)胞株中H19表達(dá)水平的改變不能直接調(diào)控胰島素生長因子2(insulin-like growth factor2，IGF2)的表達(dá)水平。H19的

11、過表達(dá)可下調(diào)JEG-3細(xì)胞HES1和雙特異性磷酸酶5(dual specificity phosphatase5，DUSP5)mRNA的表達(dá)，H19低表達(dá)可上調(diào)JAR細(xì)胞的HES1和DUSP5 mRNA的表達(dá)，提示HES1和DUSP5在H19調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能中可能起著重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用。 4.結(jié)合子癇前期H19呈印跡丟失狀態(tài)以及重度子癇前期胎盤組織IGF2、HES1mRNA表達(dá)水平均較正常晚孕胎盤組織明顯降低，H19可調(diào)

12、節(jié)HES1和DUSP5的表達(dá)的研究結(jié)果推測：在妊娠早期H19印跡丟失導(dǎo)致H19過表達(dá)，從而使HES1和DUSP5表達(dá)受阻，引起滋養(yǎng)細(xì)胞的分化障礙、促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常，從而參與子癇前期的發(fā)病。 5.不管H19是過表達(dá)還是低表達(dá)都不影響內(nèi)吞蛋白(EGFR pathway substrate15，EPS15)mRNA的表達(dá)變化，提示EPS15在H19調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能中并不起重要作用；重度子癇前期胎盤組

13、織EGFR及EPS15表達(dá)水平與正常晚孕胎盤組織比較也無明顯改變，提示EGFR及EPS15不是參與調(diào)節(jié)表皮生長因子(epidermal growthfactor，EGF)水平以及重度子癇前期發(fā)病的重要信號(hào)分子。 本研究工作是探索H19在滋養(yǎng)細(xì)胞中的生物學(xué)功能以及對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的影響的一次嘗試，為進(jìn)一步的表觀遺傳學(xué)研究奠定了良好基礎(chǔ)，為開拓H19的新功能的研究提供了有益的信息，為闡明滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制和防治策略提供了