H19在心肌肥厚中的功能研究.pdf

1、心臟是人體在胚胎發(fā)育階段最早形成的器官，也是人體最重要最保守的器官之一。心臟由心肌細(xì)胞和其他細(xì)胞(成纖維細(xì)胞，淋巴管，血管等)組成，心肌細(xì)胞數(shù)量占總數(shù)量的25％左右，體積卻占心臟體積的75%左右。心衰是導(dǎo)致人類死亡的重要原因之一，而心衰往往由心肌肥厚發(fā)展而來，因此研究心肌肥厚的發(fā)病機制具有重大的現(xiàn)實意義。心肌肥厚是心臟在早期階段為應(yīng)對各種壓力、維持心臟功能所表現(xiàn)出的適應(yīng)性反應(yīng)。然而持續(xù)的心肌肥厚和伴隨著的心肌重塑往往導(dǎo)致心衰、心源性死亡

2、的風(fēng)險增加。雖然各種特殊的肽激素、生長因子和小RNA已經(jīng)被證實參與心肌肥厚的調(diào)節(jié)，但心肌肥厚的機制依然沒有被完全了解。
　　長非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸，不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，其在生命過程中發(fā)揮重要而復(fù)雜的作用，參與諸如RNA加工，細(xì)胞命運決定，染色質(zhì)修飾等過程。有研究證實lncRNA還可以作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA

3、，ceRNA)發(fā)揮作用。最近幾年有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育與疾病過程。Braveheart lncRNA可以在小鼠胚胎干細(xì)胞分化期間刺激干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾呐K細(xì)胞。MIAT在第5外顯子上的SNP變異增加了MIAT的轉(zhuǎn)錄，可能與心肌梗塞發(fā)生相關(guān)。LncRNA ANRIL定位于9p21，它的失調(diào)會引起心肌細(xì)胞增殖異常和冠脈疾病。對TAC手術(shù)導(dǎo)致心肌肥厚的小鼠心臟組織進行轉(zhuǎn)錄組測序研究發(fā)現(xiàn)眾多l(xiāng)ncRNA在心肌肥厚早期和心衰期表達水平

4、發(fā)生明顯改變，提示 lncRNA在心肌肥厚和心衰中發(fā)揮了重要功能。因此lncRNA已逐漸成為心血管基礎(chǔ)和臨床研究的一個新的熱點和重點。
　　作為最早被發(fā)現(xiàn)的印記基因，lncRNA H19被證實在哺乳動物胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用。H19的第一外顯子能夠編碼miR-675，已有研究證實H19在很多病理生理過程中發(fā)揮的功能都是通過miR-675介導(dǎo)的。近幾年來的多項研究表明，在對病理性心肌肥厚小鼠模型進行差異表達的lncRN

5、A篩選時， H19表達水平有明顯的上調(diào)，提示其可能在心肌肥厚中發(fā)揮作用，但迄今為止關(guān)于H19在心臟組織中的具體功能及相關(guān)機制依然鮮見報導(dǎo)。
　　本研究旨在探索 H19在心肌肥厚過程中發(fā)揮的功能，并探索其相關(guān)的作用機制。我們首先在不同類型的心肌肥厚小鼠模型及人心衰標(biāo)本中檢測了 H19及其編碼的miR-675的表達，發(fā)現(xiàn)兩者在病理性心肌肥厚模型和心衰樣品中表達水平明顯上調(diào)，而在運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥厚小鼠模型中檢測時發(fā)現(xiàn)兩者的表達下調(diào)

6、。為了研究 H19在心肌細(xì)胞中的功能，我們構(gòu)建和包裝了用于過表達 H19的腺病毒，并用其在體外感染分離的原代心肌細(xì)胞。通過對心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和肥大標(biāo)志基因表達水平的檢測，發(fā)現(xiàn)過表達 H19能夠在體外抑制心肌細(xì)胞的肥大生長。另一方面，我們也在體外通過轉(zhuǎn)染 si-H19的方式來敲低原代心肌細(xì)胞中內(nèi)源性H19的表達，發(fā)現(xiàn)H19的敲低會促進心肌細(xì)胞的肥大生長。
　　為理解 H19抑制心肌細(xì)胞肥大生長的機制，我們采取了以下策略探索 H19

7、在心肌細(xì)胞中的功能是否是由miR-675介導(dǎo)的。首先，我們在體外原代心肌細(xì)胞中過表達或敲低miR-675，發(fā)現(xiàn)miR-675也能夠在體外抑制心肌細(xì)胞的肥大生長。進一步，我們在原代心肌細(xì)胞中過表達H19的同時敲低miR-675，心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和肥大標(biāo)志基因表達水平的檢測顯示，敲低miR-675能夠有效地挽救由于H19過表達所引起的心肌細(xì)胞尺寸的減小。此外，我們還分別包裝了包含缺失編碼miR-675前體序列的H19截短體(H19-Tru

8、)和突變型miR-675前體序列的H19突變體(H19-Mut)的腺病毒，并分別進行心肌細(xì)胞的感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種形式的腺病毒都能有效地使 H19在心肌細(xì)胞內(nèi)過表達，但是對心肌細(xì)胞內(nèi) miR-675的表達無明顯影響。形態(tài)學(xué)分析以及肥大標(biāo)志基因表達水平的檢測顯示H19-Tru和 H19-Mut都失去了抑制心肌細(xì)胞肥大生長的能力。所有這些結(jié)果都表明miR-675能夠介導(dǎo)H19抑制心肌細(xì)胞肥大生長的功能。
　　我們對H19/miR-67

9、5的作用機制進行了進一步探索。利用TargetScan預(yù)測了miR-675可能作用的靶分子，從中選擇了具有促進心肌肥厚功能的鈣／鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶IIδ(CaMKIIδ)進行了系統(tǒng)分析。首先，我們構(gòu)建了包含正常的及突變型的CaMKIIδ3’-UTR的熒光素酶報告載體，并與miR-675共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。結(jié)果顯示miR-675能有效地抑制CaMKIIδ的3’-UTR活性，而miR-675對突變型載體則喪失了這種抑制作用。進一步對

10、CaMKIIδ表達水平的檢測顯示miR-675能明顯抑制 CaMKIIδ在 mRNA和蛋白水平的表達。這些結(jié)果表明CaMKIIδ是miR-675直接作用的靶標(biāo)分子。為了驗證心肌細(xì)胞內(nèi)H19發(fā)揮的功能是否是由CaMKIIδ介導(dǎo)的，我們在體外原代心肌細(xì)胞中敲低H19的同時敲低CaMKIIδ，發(fā)現(xiàn)CaMKIIδ的敲低能部分緩解H19敲低所引起的心肌細(xì)胞尺寸的增加，表明CaMKIIδ能部分介導(dǎo)H19抑制心肌細(xì)胞肥大生長的功能。
　　為了研

11、究H19/miR-675在體內(nèi)心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能，我們考察了在體內(nèi)抑制miR-675的表達對TAC手術(shù)引起的心肌肥厚的影響。我們對2月齡的C57雄鼠進行了 TAC手術(shù)，在術(shù)后1周經(jīng)確認(rèn)發(fā)生心肌肥厚后，通過鼠尾靜脈注射miR-675抑制劑(antagomiR-675)，并在注射3周后進行心臟取材和分析。我們發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)應(yīng)用antagomiR-675能有效地緩解TAC手術(shù)引起的miR-675表達水平的升高，并且加重了壓力性負(fù)荷引發(fā)的心肌肥厚