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文檔簡介
1、目的:
通過成功構建負壓調控MTB感染巨噬細胞的體外模型,篩選并檢測信號軸相關基因及巨噬細胞極化相關指標,初步探索負壓調控對結核性創(chuàng)面免疫相關信號軸及巨噬細胞功能的影響,為結核性創(chuàng)面的治療提供新的思路和方法。
方法:
1、成功構建負壓調控MTB感染巨噬細胞的體外模型。
2、利用高通量測序及生物信息學分析初步篩選結核創(chuàng)面免疫相關目的基因及負壓調控后免疫相關信號軸,并利用聚類分析篩選差異性表達的巨噬細
2、胞極化相關基因,初步探索負壓調控對MTB感染巨噬細胞功能的影響。
3、選擇PPD試驗陰性、家族中無結核病史的健康體檢者為對照組;選擇脊柱結核伴創(chuàng)面患者為感染組,經VSD負壓治療30d后再次復查,并將其納入治療組。分別抽取上述人群的外周血,用Ficoll法分離外周血單個核細胞(PBMCs),提取RNA,利用RT-PCR技術驗證人體中目的基因A20及其相關信號軸基因的差異性表達。
4、體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞,并
3、將其分為3組:對照組、MTB感染組、負壓治療組。至細胞生長對數(shù)期時,分別給予上述不同條件的干預,24h后消化、收集上述細胞,再次利用RT-PCR技術對目的基因A20及其相關信號軸基因的差異性表達進行驗證。同時利用流式細胞術(FCM)檢測不同干預條件下巨噬細胞表面標志CD80、CD206的表達,以此來研究不同干預條件對巨噬細胞功能的影響。
結果:
1、高通量測序篩選及生物信息學分析發(fā)現(xiàn)基因A20相關信號通路基因呈顯著差
4、異性表達,且巨噬細胞極化相關基因IL-1、IL-6、IL-23、TNF-a較對照組呈顯著升高。
2、人外周血(PBMCs)及體外細胞實驗RT-PCR發(fā)現(xiàn),A20-NF-kB呈負調控:
2.1.蛋白激酶在人外周血(PBMCs)中A20的表達量在感染組(4.05±0.17)較對照組(1.85±0.13)明顯偏高(P<0.05);而NF-kB在感染組為(0.61±0.17)較對照組(1.13±0.37)卻明顯偏低(P<0.
5、05)。經VSD負壓治療后,A20的表達量(2.36±0.21)較感染組(4.05±0.17)有所降低(P<0.05),相應的NF-kB的表達量(0.81±0.21)較前(0.61±0.17)有所升高(P<0.05)。
2.2.在MTB感染RAW264.7細胞模型中A20的表達量感染組(6.92±0.21)低于對照組(9.75±0.33);而NF-kB的表達量感染組(24.13±0.31)卻高于對照組(8.91±0.13),差
6、異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在負壓干預條件下,A20的表達量(5.57±0.17)比感染組更低(6.92±0.21),相應的 NF-kB的表達量(33.41±0.17)比感染組(24.13±0.31)卻更高(P<0.05)。
3、MAlT1基因與A20呈同向變化:
在人外周血(PBMCs)中MALT1的表達量在感染組(5.01±0.09)較對照組(3.08±0.25)偏高(P<0.05),經VSD負壓治療后,其表
7、達量(2.05±0.08)較感染組(5.01±0.09)有所降低(P<0.05)。在MTB感染RAW264.7細胞模型中MALT1的表達量感染組(6.53±0.28)低于對照組(8.41±0.37);經負壓干預后,MALT1的表達量(3.69±0.44)比感染組更低(6.53±0.28)(P<0.05)。
4、用FCM檢測巨噬細胞表面標志發(fā)現(xiàn):MTB感染組 CD80呈顯著高表達(P<0.05),而經負壓干預后CD80的表達量更
8、高(P<0.05);而CD206的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
結論:
1、利用高通量測序及生物信息學初步預測了負壓對 A20相關信號軸及巨噬細胞極化功能的影響。
2、利用RT-PCR驗證了在人外周血(PBMCs)及體外細胞模型中A20-NF-kB呈負調控,與生物信息學篩查結果一致,且在人(PBMCs)及體外細胞模型中負壓調控均能降低A20、升高NF-kB。
3、而MALT1與A20呈
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