2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景
  人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)又稱人類皰疹病毒5型,是皰疹病毒科β亞科的一種常見(jiàn)病毒,廣泛存在于自然界中,人是其唯一宿主。HCMV是目前已知的引起孕婦活動(dòng)性感染、胚胎及胎兒宮內(nèi)感染的最常見(jiàn)病原體。孕期母體感染HCMV后,可通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播或者生殖道逆行傳播給胎兒,引起胚胎或胎兒宮內(nèi)感染。HCMV宮內(nèi)感染可導(dǎo)致胚胎停育、流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等異常妊娠結(jié)局,以及新生兒認(rèn)

2、知能力發(fā)育落后、智力低下、感音神經(jīng)性耳聾等嚴(yán)重遠(yuǎn)期后果。目前HCMV發(fā)生宮內(nèi)傳播及引起胎兒發(fā)育異常的具體機(jī)制和途徑尚不清楚,HCMV感染胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞被認(rèn)為是啟動(dòng)宮內(nèi)感染的第一步。絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous cytotrophoblast,EVT)增殖、侵襲能力下降,導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈重鑄不良,胎盤(pán)物質(zhì)交換功能低下,是流產(chǎn)、死胎、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、腦發(fā)育落后等異常妊娠的重要病理生理機(jī)制。
  研究目的
  體外研

3、究HCMV經(jīng)Hippo-YAP信號(hào)通路對(duì)早孕EVT功能的影響。
  研究方法
  1.無(wú)菌收集早孕絨毛組織,應(yīng)用改良的復(fù)合酶消化梯度離心法分離、培養(yǎng)原代EVT;
  2.通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)CK7、Vim、c-erbB-2表達(dá)情況鑒定細(xì)胞來(lái)源;
  3.常規(guī)培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞株,擴(kuò)增HCMVAD169病毒株,并根據(jù)Reed-Muench法測(cè)定TCID50;
  4.將HCMVAD169病

4、毒液接種于EVT培養(yǎng)基中,通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)HCMVpp65抗原,以確定HCMV感染EVT情況;
  5.MTT比色法檢測(cè)HCMV對(duì)EVT體外增殖的影響,為后續(xù)試驗(yàn)篩選最佳病毒接種劑量;
  6.實(shí)驗(yàn)分為正常組(EVT)及病毒組(EVT+HCMV);
  7.熒光定量PCR檢測(cè)HCMV經(jīng)Hippo-YAP信號(hào)通路對(duì)EVT表達(dá)Mst1、Mst2、SAV、Lats1、Lats2、Mob1、YAP、TAZ、TEAD

5、1~4mRNA水平的影響;
  8.免疫熒光化學(xué)染色法、Western blot技術(shù)檢測(cè)正常組及病毒組YAP蛋白水平,以了解HCMV對(duì)EVT的YAP蛋白表達(dá)的影響。
  9.體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCMV對(duì)EVT侵襲功能的影響。
  研究結(jié)果
  1.倒置顯微鏡下見(jiàn)分離的原代細(xì)胞貼壁后呈三角形或不規(guī)則多邊形,平鋪片狀生長(zhǎng);
  2.細(xì)胞來(lái)源鑒定結(jié)果顯示,幾乎所有分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞均可見(jiàn)CK7和c-erbB-2

6、表達(dá),極少數(shù)可見(jiàn)Vim表達(dá),提示實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)獲得的原代細(xì)胞為高純度EVT;
  3.病毒擴(kuò)增后測(cè)定HCMV AD169病毒株TCID50為10-4.15/0.1 ml;
  4.EVT培養(yǎng)基中接種HCMV后,免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示病毒組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量紅色HCMV pp65抗原陽(yáng)性信號(hào)表達(dá),正常組細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá);
  5.MTT檢測(cè)顯示,與正常組相比較,接種病毒48h時(shí),30μl、40μl、50μl、70μl

7、、100μlHCMV病毒液對(duì)EVT增殖有明顯抑制作用(P<0.05),30μl、40μl、50μl各組間無(wú)明顯差異(P>0.05),故選擇30μl100TCID50 HCMV/120μl培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);
  6.熒光定量PCR顯示,兩組EVT中均有Mst1、Mst2、SAV、Lats1、Lats2、Mob1、YAP、TAZ、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4基因mRNA表達(dá),各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量正常組為(1.0

8、00±0.014,1.000±0.036,1.000±0.025,1.001±0.047,1.000±0.016,1.001±0.067,1.002±0.067,1.000±0.017,1.001±0.053,1.001±0.050,1.000±0.039,1.009±0.160)、病毒組為((0.805±0.015,0.818±0.027,0.929±0.021,0.721±0.032,0.734±0.005,0.388±0.019,

9、0.623±0.022,0.587±0.012,0.488±0.010,0.501±0.012,0.652±0.016,0.625±0.026),病毒組與正常EVT組相比較,各基因mRNA表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05);
  7.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)結(jié)果顯示兩組細(xì)胞均有YAP蛋白表達(dá),正常組EVT細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有YAP蛋白表達(dá),病毒組EVT表達(dá)YAP細(xì)胞核定位減少,正常組與病毒組陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(averag

10、e optical density,AOD)分別為0.271±0.024和0.159±0.017,與正常EVT組相比較,病毒組EVT表達(dá)YAP蛋白水平明顯降低(P<0.05);
  8.Western blot檢測(cè)顯示兩組細(xì)胞均有YAP蛋白表達(dá),正常組與病毒組YAP蛋白表達(dá)的灰度值分別為1.02±0.056和0.65±0.071,與正常EVT組相比較,病毒組EVT表達(dá)YAP蛋白水平明顯降低(P<0.05);
  9.體外細(xì)胞

11、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常組和病毒組EVT均有細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠,兩組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(55.7±2.95)個(gè)和(47.9±3.21)個(gè),與正常組相比較,病毒組穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05),提示HCMV降低EVT侵襲活力。
  結(jié)論
  1.EVT是HCMV的允許細(xì)胞,HCMV可體外感染EVT,在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并抑制其增殖,EVT感染HCMV可作為HCMV宮內(nèi)感染的模型;
  2.HCMV可能影響EVT細(xì)胞Hipp

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