Hfq對(duì)霍亂弧菌環(huán)境適應(yīng)能力的影響及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、目的：構(gòu)建霍亂弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株和缺失回補(bǔ)株，分析Hfq蛋白對(duì)霍亂弧菌環(huán)境適應(yīng)能力的影響，驗(yàn)證Hfq對(duì)環(huán)境生存及致病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。
　　 方法：1.PCR方法擴(kuò)增霍亂弧菌C7258菌株hfq基因的上、下游片段，作為上和下游同源臂，搭橋PCR方法擴(kuò)增將上、下游同源臂連接。搭橋PCR片段和自殺質(zhì)粒pWM91分別進(jìn)行雙酶切，之后用連接酶進(jìn)行連接，獲得重組自殺質(zhì)?！鱤fq-pMW91，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SM10λp

2、ir株。采用同源重組方法，通過結(jié)合將自殺質(zhì)?！鱤fq-pMW91轉(zhuǎn)入霍亂弧菌C7258菌株，利用慶大霉素和氨芐青霉素雙抗平板和pWM91質(zhì)粒的sacB基因在蔗糖平板上殺死供體菌的方法構(gòu)建霍亂弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株，并進(jìn)行PCR鑒定。2.PCR方法擴(kuò)增hfq基因，獲得完整的基因片段△hfq-C，將△hfq-C片段和pUC18克隆載體分別進(jìn)行XbaⅠ和HidⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切，連接酶連接2酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SM10λ

3、pir菌株中，獲得重組克隆載體△hfq-C-pUC18。將△hfq-C-pUC18重組克隆載體電轉(zhuǎn)入△hfq缺失株中，獲得△hfq-C回補(bǔ)株，篩選陽性克隆病用PCR鑒定。3.PCR方法擴(kuò)增hfq基因，獲得hfq-P片段，限制性內(nèi)切酶BamH(Ⅰ)和HidⅢ分別雙酶切hfq-P片段和表達(dá)載體pET28a，將酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，獲得Hfq蛋白表達(dá)株hfq-P-BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行12％SDS

4、-PAGE蛋白電泳。4.通過對(duì)野生株、突變株、回補(bǔ)株在富氧、缺氧、膽鹽、M9環(huán)境下的生長(zhǎng)狀態(tài)，從初始培養(yǎng)到平臺(tái)期整個(gè)過程，每隔1小時(shí)測(cè)定D600nm，重復(fù)三次，用平均值繪成生長(zhǎng)曲線，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較差異;將野生株、突變株、回補(bǔ)株點(diǎn)在Swim平板上，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)菌的游動(dòng)能力，光學(xué)顯微鏡觀察野生株、突變株、回補(bǔ)株菌落的透明度及褶皺程度，對(duì)野生株、突變株、回補(bǔ)株培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行結(jié)晶紫染色，并測(cè)定D570nm;野生株和突變株對(duì)不同濃

5、度的去污劑SDS及慶大霉素的抗性能力比較及應(yīng)對(duì)H2O2刺激的敏感性測(cè)定，從而比較霍亂弧菌野生株和Hfq突變株在營養(yǎng)受限條件下細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成、外膜抗性和氧化應(yīng)激能力上的差異。5.針對(duì)霍亂弧菌△hfq缺失株表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)可能的相關(guān)調(diào)控基因，并提取霍亂弧菌野生株和缺失株的RNA，應(yīng)用熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)對(duì)Hfq可能調(diào)控的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較，靶基因涉及鞭毛合成，胞外多糖合成，外膜蛋白，整體

6、調(diào)控子以及氧化應(yīng)激相關(guān)。
　　 結(jié)果：1.通過基因敲除-同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了霍亂弧菌C7258菌株的△hfq缺株。2.通過融合PCR技術(shù)和電轉(zhuǎn)化技術(shù)成功構(gòu)建了霍亂弧菌△hfq缺失株的△hfq-C/△hfq回補(bǔ)株。3.通過融合PCR技術(shù)和鈣轉(zhuǎn)化技術(shù)成功構(gòu)建了大腸桿菌hfq-P-BL21(DE3)-DH5αλpir蛋白表達(dá)株。4.Hfq蛋白激活與鞭毛合成及功能相關(guān)基因fliA，flaA，flaC，motA，motX轉(zhuǎn)錄從而增強(qiáng)霍亂

7、弧菌的游動(dòng)能力;但Hfq蛋白不調(diào)控galU和galE的轉(zhuǎn)錄，提示Hfq蛋白不影響霍亂弧菌的脂多糖結(jié)構(gòu);Hfq蛋白抑制胞外多糖的合成基因vpsT和vpsA轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制VPS合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子vpsR轉(zhuǎn)錄，達(dá)到抑制生物膜形成的作用。5.Hfq蛋白激活外膜蛋白OmpU和OmpT轉(zhuǎn)錄，起到提高外膜抗性能力。6.Hfq蛋白抑制katE和sodC的轉(zhuǎn)錄，激活phoB和katG的轉(zhuǎn)錄，相對(duì)作用的最終結(jié)果是Hfq蛋白提高抵御氧化應(yīng)激的能力。7.Hfq蛋