國產(chǎn)水痘減毒活疫苗株即刻早期基因ORF62特征的分析.pdf

1、目的:
　　通過比較兩株國產(chǎn)水痘減毒活疫苗株(vOka)與其父系株(pOka)的即刻早期基因ORF62啟動(dòng)子區(qū)序列、啟動(dòng)子的啟動(dòng)活力和啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序的差異，以及ORF62編碼區(qū)序列及其編碼即刻早期蛋白(IE62)反式激活力的差異，探討vOka株ORF62突變在其減毒機(jī)制中的可能作用。
　　方法:
　　1、應(yīng)用分子克隆技術(shù)克隆構(gòu)建長春百克生物科技股份公司vOka-BK株、上海生物制品研究所vOka-SH株、葛蘭

2、素-史克公司vOka-GSK株（對照）及其父系pOka株ORF62啟動(dòng)子的啟動(dòng)子-報(bào)告子質(zhì)粒，以及ORF62編碼區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒。
　　2、應(yīng)用基因測序技術(shù)測定三株vOka與其父系株pOka的ORF62啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)序列并分析其差異。
　　3、應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序(motif)掃描軟件TFSEARCH分析三株vOka與其父系株pOka的ORF62啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序并比較其差異。
　　4、應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析

3、三株vOka與其父系株pOkaORF62啟動(dòng)子的啟動(dòng)活力以及ORF62編碼蛋白IE62對即刻早期（IE）基因ORF4、早期(E)基因ORF28和晚期(L)基因ORF67啟動(dòng)子反式激活力的差異。
　　結(jié)果:
　　1、與父系株pOka比較，三株vOka的ORF62啟動(dòng)子區(qū)110，050位點(diǎn)存在一致性T缺失突變。
　　2、三株vOkaORF62啟動(dòng)子區(qū)110，050位點(diǎn)T缺失突變未導(dǎo)致啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序改變。
　

4、　3、在pOka株或vOka株IE62激活下，三株vOkaORF62啟動(dòng)子的啟動(dòng)活力均顯著低于其父系株pOka。
　　4、三株vOkaORF62編碼區(qū)存在一致性106，262位點(diǎn)T→C置換突變、107，136位點(diǎn)T→C置換突變、107，252位點(diǎn)T→C置換突變，這些堿基置換突變各新增一個(gè)限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、NaeⅠ和BssHⅡ的酶切新位點(diǎn)。
　　5、除vOka-SH株IE62在CV-1細(xì)胞中對即刻早期基因ORF4啟動(dòng)子的反

5、式激活力顯著低于pOka株外，三株vOkaIE62在CV-1和MeWo細(xì)胞中對即刻早期基因ORF4、早期基因ORF28和晚期基因ORF67啟動(dòng)子的反式激活力均顯著高于pOka株。
　　結(jié)論:
　　1、三株vOkaORF62啟動(dòng)子區(qū)110，050位點(diǎn)存在的T缺失突變可能是其啟動(dòng)子啟動(dòng)活力降低以及IE62反式激活力改變的原因之一。
　　2、三株vOkaORF62啟動(dòng)子區(qū)110，050位點(diǎn)T缺失突變區(qū)轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合基序并