ROCK激酶在Ⅱ型登革病毒感染誘導(dǎo)波形蛋白纖維重排中的作用研究.pdf

1、登革病毒(dengue virus，DENV)是黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，根據(jù)其E蛋白的抗原性不同，可分為四種血清型，即DENV1-4。登革病毒主要通過蚊媒傳播，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，引起人類登革熱(dengue fever，DF)和登革出血熱/休克綜合癥(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/DSS)。全世界每年約有5000萬(wàn)至1億感染者，其中約50萬(wàn)為

2、DHF/DSS患者，如未及時(shí)治療致死率可高達(dá)50%，登革病毒感染已成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題。而目前對(duì)于DENV感染仍無(wú)有效的疫苗和特異性藥物，預(yù)防主要依賴于對(duì)蚊媒的控制。因此深入研究DENV與宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制，將有助于闡明DENV的致病機(jī)制和尋找防治的突破點(diǎn)。
　　 病毒是一類具有高度寄生性的微生物，它完全依賴宿主細(xì)胞的能量和代謝系統(tǒng)，獲取生命活動(dòng)所需的物質(zhì)與能量。病毒的復(fù)制和裝配通常在細(xì)胞內(nèi)的特定區(qū)域進(jìn)行，多種病毒在核

3、周區(qū)域或者細(xì)胞質(zhì)中形成由細(xì)胞骨架、細(xì)胞器、特定的細(xì)胞內(nèi)膜構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu)，稱為“病毒工廠”(virus factories)，其功能可能是為病毒的復(fù)制和裝配提供了相對(duì)獨(dú)立的空間，以排除宿主細(xì)胞蛋白酶和細(xì)胞器對(duì)復(fù)制過程的干擾。黃病毒科病毒的病毒工廠構(gòu)成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體密切相關(guān)，而DENV在宿主細(xì)胞中形成的病毒工廠的構(gòu)成尚不清楚。有研究表明，多種病毒的病毒工廠構(gòu)建過程與波形蛋白纖維密切相關(guān)。我們的前期工作顯示：DENV2感染可誘導(dǎo)E

4、CV304細(xì)胞波形蛋白纖維發(fā)生重排，波形蛋白絲從細(xì)胞邊緣回縮并環(huán)繞細(xì)胞核，與病毒蛋白呈共同分布，利用丙烯酰胺破壞波形蛋白纖維，可明顯抑制DENV2的復(fù)制和產(chǎn)生，但其機(jī)制尚不清楚。波形蛋白纖維的重排通常是由激酶磷酸化其頭部區(qū)結(jié)構(gòu)域所致，研究表明激活ROCK激酶(Rho-associatedcoiled coil-containing kinase，ROCK)使波形蛋白頭部磷酸化位點(diǎn)Ser71磷酸化而發(fā)生重排，但其是否在DENV2感染誘導(dǎo)波

5、形蛋白纖維重排中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步研究。
　　 基于ROCK激酶在波形蛋白纖維重排中的重要作用，以及DENV2感染引起波形蛋白纖維重排這一現(xiàn)象，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究擬以ROCK激酶為主要研究對(duì)象，觀察波形蛋白纖維、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體與DENV2病毒工廠構(gòu)成的關(guān)系，檢測(cè)DENV2感染后宿主細(xì)胞波形蛋白磷酸化水平及ROCK激酶活性的變化的改變，并利用特異性抑制劑抑制ROCK激酶活性，驗(yàn)證DENV2感染可能激活ROCK激酶活

6、性、誘導(dǎo)波形蛋白磷酸化和重排、參與形成病毒工廠的推論，闡明ROCK激酶在DENV2感染誘導(dǎo)波形蛋白纖維重排中的作用，為預(yù)防和控制DENV2感染提供新思路。
　　 本研究的主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察波形蛋白纖維及相關(guān)細(xì)胞器與DENV2病毒工廠構(gòu)成的關(guān)系
　　 本實(shí)驗(yàn)使用標(biāo)記物質(zhì)特異性標(biāo)記細(xì)胞波形蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體，以細(xì)胞免疫熒光染色觀察波形蛋白纖維及相關(guān)細(xì)胞器與DENV2病毒工廠構(gòu)成

7、的關(guān)系。結(jié)果顯示：對(duì)照組波形蛋白纖維從細(xì)胞核至細(xì)胞邊緣呈網(wǎng)狀分布，而DENV2感染組細(xì)胞波形蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)塌陷發(fā)生重排，主要表現(xiàn)為(1)波形蛋白纖維絲由細(xì)胞邊緣回縮至細(xì)胞核一側(cè)聚集，形成包繞病毒NS1/E蛋白的籠狀結(jié)構(gòu)(2)波形蛋白纖維絲由細(xì)胞邊緣回縮環(huán)繞細(xì)胞核，與病毒NS1/E蛋白呈明顯共分布；對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在胞質(zhì)內(nèi)呈均勻彌漫分布，而DENV2感染組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回縮聚集于核周，與病毒NS1/NS3蛋白呈明顯共分布：高爾基體形態(tài)及分布

8、未發(fā)生明顯改變，在感染后48h可觀察到與病毒E蛋白呈共分布；線粒體在感染后48h形態(tài)由管網(wǎng)狀變?yōu)辄c(diǎn)泡狀，沒有與病毒蛋白共分布。結(jié)果提示高爾基體可能與病毒結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟有關(guān)，線粒體可能參與了病毒導(dǎo)致的線粒體途徑的凋亡過程，兩者似乎并不參與DENV2病毒工廠的形成。而波形蛋白纖維和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能共同參與了DENV2在ECV304細(xì)胞中病毒工廠的形成。
　　 2.DENV2感染誘導(dǎo)的波形蛋白纖維重排與波形蛋白Ser71磷酸化密切相關(guān)

9、
　　 ROCK激酶可以特異性地使波形蛋白頭部磷酸化位點(diǎn)Ser71磷酸化，從而導(dǎo)致波形蛋白纖維發(fā)生重排，因此本實(shí)驗(yàn)使用能識(shí)別Ser71磷酸化波形蛋白的單克隆抗體，以細(xì)胞免疫熒光染色觀察DENV2感染后Ser71磷酸化波形蛋白與病毒蛋白的分布關(guān)系。結(jié)果顯示：Ser71磷酸化的波形蛋白纖維分布與DENV2感染誘導(dǎo)波形蛋白重排形成的結(jié)構(gòu)相似，且與病毒蛋白明顯共存。這提示DENV2誘導(dǎo)的波形蛋白纖維重排與波形蛋白Ser71磷酸化密切相關(guān)

10、，DENV2感染可能通過激活ROCK激酶使波形蛋白Ser71磷酸化導(dǎo)致波形蛋白纖維發(fā)生重排。
　　 3.DENV2感染導(dǎo)致ECV304細(xì)胞內(nèi)波形蛋白纖維發(fā)生重排，使用Y-27632抑制ROCK激酶活性能顯著抑制波形蛋白纖維重排現(xiàn)象。
　　 免疫熒光染色結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞各時(shí)相點(diǎn)波形蛋白纖維形態(tài)沒有明顯變化，從細(xì)胞核至細(xì)胞邊緣呈網(wǎng)狀分布，而DENV2感染組細(xì)胞感染后30min時(shí)即可觀察到波形蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)開始塌陷，纖維

11、絲由細(xì)胞邊緣回縮，感染后1h時(shí)波形蛋白纖維重排至核周區(qū)域，聚集于細(xì)胞核一側(cè)，感染后8h時(shí)波形蛋白纖維環(huán)繞細(xì)胞核，感染后24h時(shí)波形蛋白纖維以上述兩種重排后的形態(tài)共同存在，并呈濃縮分布使局部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。這一結(jié)果提示波形蛋白纖維發(fā)生重排與DENV2在ECV304細(xì)胞中的感染與復(fù)制周期密切相關(guān)。
　　 使用ROCK激酶特異性抑制劑Y-27632抑制ROCK激酶活性后進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，以免疫熒光染色觀察波形蛋白纖維的形態(tài)變化。結(jié)果顯示：只

12、加入DENV2的對(duì)照組中波形蛋白纖維發(fā)生重排，而Y-27632藥物處理組各時(shí)間點(diǎn)的波形蛋白纖維形態(tài)保持了原有的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未發(fā)生明顯的形態(tài)變化。這提示ROCK激酶在DENV2感染誘導(dǎo)的波形蛋白纖維重排中發(fā)揮了重要作用，使用藥物抑制ROCK激酶活性能顯著抑制DENV2感染誘導(dǎo)的波形蛋白纖維重排。
　　 4.DENV2感染導(dǎo)致波形蛋白Ser71磷酸化水平顯著升高，使用Y-27632抑制ROCK激酶活性能顯著抑制波形蛋白Ser71磷

13、酸化
　　 為進(jìn)一步研究波形蛋白Ser71磷酸化在DENV2感染中的作用，本實(shí)驗(yàn)使用能識(shí)別Ser71磷酸化波形蛋白的單克隆抗體，以Western blot檢測(cè)DENV2感染后ECV304細(xì)胞內(nèi)波形蛋白表達(dá)及Ser71磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示：DENV2感染過程中各時(shí)相點(diǎn)的波形蛋白表達(dá)沒有明顯差異，而Ser71磷酸化水平在感染后30min時(shí)升高至對(duì)照組的176.3%，8h時(shí)增高至對(duì)照組的333.2%達(dá)到峰值，12h時(shí)呈明顯下降的

14、趨勢(shì)，達(dá)到對(duì)照組的203.5%，其余時(shí)間點(diǎn)相比對(duì)照組沒有顯著差異。這一結(jié)果提示DENV2感染過程中波形蛋白表達(dá)量未受影響，但Ser71磷酸化水平變化與DENV2的感染和復(fù)制過程密切相關(guān)。
　　 使用ROCK激酶特異性抑制劑Y-27632抑制ROCK激酶活性后進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，以Western blot檢測(cè)波形蛋白Ser71磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示：與只加入DENV2的對(duì)照組相比，Y-27632藥物處理組各時(shí)間點(diǎn)的Ser71磷酸化波

15、形蛋白水平顯著降低，感染后30min時(shí)降低至對(duì)照組的51.42%，1h時(shí)降低至42.420/0，8h時(shí)降低至54.01%，24h時(shí)降低至46.76%。結(jié)果提示ROCK激酶在DENV2感染復(fù)制過程中發(fā)揮了重要作用，使用藥物持續(xù)抑制ROCK激酶活性能顯著抑制DENV2感染誘導(dǎo)的波形蛋白Ser71磷酸化，從而抑制波形蛋白纖維發(fā)生重排。
　　 5.DENV2感染導(dǎo)致ROCK激酶活性水平顯著升高
　　 本實(shí)驗(yàn)使用ROCK激酶活性檢

16、測(cè)試劑盒，分別檢測(cè)滅活病毒感染的對(duì)照組和一般感染組ECV304細(xì)胞中不同時(shí)相點(diǎn)ROCK激酶活性水平。結(jié)果顯示：在感染后15min、30min和8h時(shí)ROCK激酶活性較對(duì)照組顯著升高，15min時(shí)升高了243.75%，30min時(shí)下降至177.19%，8h時(shí)升高至216.18％，其余時(shí)間點(diǎn)ROCK激酶水平較對(duì)照組沒有明顯變化。這一結(jié)果提示ROCK激酶活性主要是在DENV2吸附和穿入ECV304細(xì)胞的過程中明顯升高，之后回復(fù)初始水平，而在病

17、毒從ECV304細(xì)胞中釋放的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)8h時(shí)再次明顯上升，然后降低至初始水平。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步確定DENV2感染導(dǎo)致ECV304細(xì)胞波形蛋白纖維重排，并和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一起參與DENV2病毒工廠的形成；病毒感染過程中ROCK激酶活性明顯升高，并引發(fā)其所對(duì)應(yīng)波形蛋白Ser71磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平升高；使用藥物抑制ROCK激酶活性能顯著抑制DENV2感染誘導(dǎo)的波形蛋白Ser71磷酸化和波形蛋白纖維重排。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步驗(yàn)證了D