小鼠精原細(xì)胞體外培養(yǎng)特性及冷凍保存.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是精子發(fā)生的干細(xì)胞，是成年動(dòng)物體內(nèi)具備自我更新和多向分化潛能的二倍體永生細(xì)胞群。十幾年來，SSCs移植技術(shù)的發(fā)展為SSCs的相關(guān)研究提供了極大便利，使SSCs的研究更加深入。為了給小鼠SSCs的體外分化、轉(zhuǎn)基因、移植等體外操作提供理論依據(jù)和技術(shù)方法，本研究主要進(jìn)行了小鼠精原細(xì)胞(含SSCs)的體外培養(yǎng)特性及冷凍保存研究。結(jié)果如下： 1、為研究小鼠精原細(xì)胞的

2、體外存活、增殖特性，優(yōu)化其體外培養(yǎng)體系，本實(shí)驗(yàn)利用7日齡昆白系小鼠睪丸，一步酶法分離獲得生精上皮單細(xì)胞懸液(主要含精原細(xì)胞和支持細(xì)胞)，分別接種于D-MEM、D-MEM/F12和KSOM后系統(tǒng)研究了精原細(xì)胞的存活和增殖情況。結(jié)果顯示，小鼠精原細(xì)胞在D-MEM和D-MEM/F12中均能存活并增殖，表現(xiàn)為在培養(yǎng)的第1～9天/1～8天呈逐漸減少趨勢，第9～13天/8～12天呈增殖趨勢，第17天/16天以后增殖減緩，而小鼠精原細(xì)胞在KSOM中只

3、短暫存活不能增殖。 2、為摸索小鼠精原細(xì)胞單細(xì)胞形式以及功能性結(jié)構(gòu)形式(曲細(xì)精管和完整睪丸)冷凍保存方法，本實(shí)驗(yàn)以10％DMSO為冷凍保護(hù)劑，對生精上皮單細(xì)胞、曲細(xì)精管及完整睪丸進(jìn)行了-70℃冷凍保存，同時(shí)對生精上皮單細(xì)胞進(jìn)行了液氮冷凍保存，并對凍存后細(xì)胞進(jìn)行了培養(yǎng)。結(jié)果顯示，完整睪丸、曲細(xì)精管及生精上皮單細(xì)胞經(jīng)1周凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率分別為85.754±2.24％、93.284±0.37％和90.21±0.89％，曲細(xì)精管經(jīng)2

4、周凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為91.27±0.39％，生精上皮單細(xì)胞經(jīng)2周、1個(gè)月和3個(gè)月液氮凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率分別為91.17±1.47％、90.51±1.34和89.73±2.51％。復(fù)蘇后精原細(xì)胞培養(yǎng)第10天出現(xiàn)旺盛增殖行為。 3、為探索小鼠精原細(xì)胞的純化方法，驗(yàn)證小鼠精原細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的可行性。本實(shí)驗(yàn)用機(jī)械震搖法對處于旺盛增殖期的精原細(xì)胞集落進(jìn)行了純化，并分別接種于未包被培養(yǎng)板及明膠包被培養(yǎng)板后進(jìn)行培養(yǎng)，詳細(xì)觀察了精原細(xì)胞