丙酸睪丸素對小鼠精原細胞體外縱向分化的影響的實驗研究.pdf

1、目的：建立體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)精原細胞，為精原干細胞研究提供實驗模型；在雄激素的作用下，觀察精原細胞在體外分化過程中的變化，以了解精子發(fā)生中睪丸支持細胞以及雄性激素在精原細胞分化中所起的作用，為闡明精子發(fā)生所依賴的微環(huán)境提供實驗依據。 方法：①飼養(yǎng)單層的制備：選取7-8天左右雄性小鼠，抽吸股骨骨髓基質細胞(bonemarrowstromalcells，BMSC)做原代培養(yǎng)3-4天，待基質細胞伸出長突起、相互交織形成單層細胞并鋪滿瓶

2、壁面積達70％時，用含10μg/ml絲裂霉素C的IMDM培養(yǎng)基處理1.5小時，充分清洗后作為飼養(yǎng)層備用；②睪丸支持細胞的分離純化：在無菌條件下剖腹取出7-8天左右雄性小鼠雙側睪丸，經組合酶消化，在鏡下監(jiān)測，待生精小管基本解離成單個細胞團時，用含血清的IMDM終止消化，離心棄去上清液，將細胞懸液平均接種在25ml的培養(yǎng)瓶中，瓶中預先放有0.1％多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，調整細胞密度為3×105個/ml，置37℃，5％CO2飽和濕度條件下培

3、養(yǎng)，4小時后換液加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),24小時后，每瓶加入1.5ml20mmolTris-HCL液低滲處理3分鐘，D-Hanks液清洗3次，加入培養(yǎng)基在同上條件下培養(yǎng)，待支持細胞融合成片時及時傳代，平均接種于六孔板中。③接種精原細胞：同法取7-8天左右雄性小鼠睪丸，按上述酶消化過程制備精原細胞懸液，并將懸液接種在制備好的BMSC飼養(yǎng)層上，置于34℃，5％CO2飽和濕度條件下共培養(yǎng)，72小時后，以特制的內徑50-100μm的毛細玻璃彎管在倒

4、置相差顯微鏡下將精原細胞克隆球吸出，吹打均勻后加入胰酶，制成單細胞懸液，平均分配到六孔板中與睪丸支持細胞共同培養(yǎng)。④加入丙酸睪丸素：設置實驗組和空白對照組，在實驗組的共培養(yǎng)體系中加入不同劑量的丙酸睪丸素，濃度分別為0.1μmol/L；0.2μmol/L；0.5μmol/L；1.0μmol/L；1.5μmol/L，同時培養(yǎng)BMSC作為流式細胞儀二倍體內部參照組。⑤檢測：在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化并照相；對培養(yǎng)的精原細胞進行堿性磷

5、酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)染色、c-kit受體檢測；對培養(yǎng)的支持細胞進行H&E染色、油紅染色；對空白組和實驗組，運用流式細胞儀進行DNA倍性分析，了解各組的單倍體細胞率。 結果：①精原細胞在BMSC飼養(yǎng)層上克隆生長，培養(yǎng)72小時，細胞增殖達到高峰，形成4-16個，甚至32個由細胞間橋相連成串的細胞團，細胞表達c-kit受體陽性,ALP染色陽性。②經分離純化得到了高純度的睪丸支持細胞，鏡下觀察呈不規(guī)則的

6、多邊形，胞質中見空泡，油紅染色呈橘黃色，提示為脂質小體；③精原細胞與支持細胞共培養(yǎng)，在丙酸睪丸素的作用下，不同的濃度組均表現出向子代分化的趨勢，但各組的分化率不同，經流式細胞儀分析，以0.5μmol/L組分化率最高，經四格表χ2檢驗差異具有顯著性(P＜0.01)。 結論：①精原細胞和睪丸支持細胞的共生性培養(yǎng)，可使這些細胞在培養(yǎng)過程中重新建立起聯系并進行增殖，能成功地為精原細胞體外縱向誘導分化的研究提供細胞實驗模型。②雄性激素是精