阻斷雙信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)同種異體T細(xì)胞的活性介導(dǎo)免疫耐受.pdf

1、目的： 異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT)是目前根治白血病、骨髓增殖異常綜合癥、淋巴瘤等惡性血液系統(tǒng)疾病和重型再生障礙性貧血，以及某些遺傳性疾病、免疫缺陷病、自身免疫性疾病的最有效方法之一。排斥、移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)與感染是其主要合并癥，三者中尤以后二者最為突出。因?yàn)楦腥境?/p>

2、在GVHD和治療GVHD所繼發(fā)的免疫功能低下的基礎(chǔ)上發(fā)生，所以，實(shí)際上因供受者主要或次要組織相容性抗原(majororminorhistocompatibilityantigen，MHC/mHC)存在差異而引起的GVHD是allo-HSCT最主要的合并癥，亦是影響移植成敗的關(guān)鍵問題。 本研究旨在探討一條降低GVHD而又保留GVL效應(yīng)的移植新途徑，為誘導(dǎo)allo-HSCT的免疫耐受提供新的方法。 本研究以單相混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mi

3、xedlymphocytereaction，MLR)為反應(yīng)體系，體外模擬allo-HSCT，在同種異體正常反應(yīng)T細(xì)胞存在下，體外聯(lián)合應(yīng)用TJU103和CTLA4-Ig分別阻斷同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞活化的抗原識(shí)別信號(hào)和共刺激分子信號(hào)途徑，通過檢測(cè)供者T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒活性、免疫和克隆表型以及分泌細(xì)胞因子的濃度探討：①二者聯(lián)合應(yīng)用能否誘導(dǎo)對(duì)以接觸的抗原產(chǎn)生耐受；②如果能誘導(dǎo)免疫耐受，其可能的機(jī)制；③是否影響對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

4、實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分：人T細(xì)胞克隆分析技術(shù)和TCR基因重排方法的建立 1.設(shè)計(jì)并合成人TCRαβT細(xì)胞26個(gè)TCRBV(TCRβchainvariablegene，TCRBV)家族的上游引物和共用的TCRBC(TCRβchainconstantgene，TCRBC)下游引物(帶FAM標(biāo)記)：設(shè)計(jì)并合成人34個(gè)TCRAV(TCRαchainvariablegene，TCRAV)家族的上游引物和共用的TCRAC(TCRαch

5、ainconstantgene，TCRAC)的下游引物(內(nèi)側(cè)端引物帶FAM標(biāo)記)；在人TCRBC基因中合成實(shí)驗(yàn)對(duì)照的TCRBC1、TCRBC2上游引物。分別以T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat和Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株Raji作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以正常健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)和正常分娩的臍血單個(gè)核細(xì)胞(cordbloodmononuclearcell，CBMC)為

6、研究樣本，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增并用1.5％瓊脂糖凝膠檢測(cè)24個(gè)TCRBV基因家族和32個(gè)TCR基因家族包含完整CDR3區(qū)段的cDNA，采用6％測(cè)序膠基因掃描分析單克隆水平Jurkat細(xì)胞和群體多克隆水平正常人PBMC中TCRαβT細(xì)胞α和β鏈的CDR3基因譜系多態(tài)性和長(zhǎng)度分布，建立穩(wěn)定地監(jiān)測(cè)TCRαβT細(xì)胞克隆分析技術(shù)。 2.根據(jù)TCR基因有效重排時(shí)參與因素的復(fù)雜性，選取TCR基因剪切和連接(非同源末端重組

7、系統(tǒng)，non-homologousend-oiningmachinery，NHEJ)的主要調(diào)控蛋白：重組酶激活基因酶(RecombinationActivatingGene，RAG)、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeonucieotidyltransferase，TdT)、Ku70和Ku80連接蛋白為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)合成各蛋白基因上下游引物。以胸腺組織，Jurkat細(xì)胞和正常人的PBMC為研究對(duì)象(可分別作為本研究的陽(yáng)性、陰性

8、對(duì)照。參照文獻(xiàn)和本校分子免疫學(xué)研究所的研究，Jurkat細(xì)胞的重排體系是開放的，可與胸腺一起作為陽(yáng)性對(duì)照)，提取各樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscript-polymerasechainreaction，RT-PCR)檢測(cè)其mRNA的表達(dá)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 第二部分：TJU103聯(lián)合CTLA4-g誘導(dǎo)供者T細(xì)胞的免疫耐受 常規(guī)分離正常人PBMC12份，等分成6份，分別作為供者和受者，以供者

9、的PBMC作為反應(yīng)細(xì)胞，MMC處理分成的PBMC作為受者刺激細(xì)胞，體外建立模擬allo-HSCT供、受者間的單相混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)MLR體系，分成TJU103組、CTLA4-Ig組、聯(lián)合組，分別加入25mg/L的TJU103、15mg/L的CTLA4-Ig、等濃度的TJU103和CTLA4-Ig，設(shè)單純對(duì)照組，進(jìn)行5天標(biāo)準(zhǔn)的單相MLR。分別應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(memylthiazolyltetrazolium，MTT)還原法和LDH釋放法

10、檢測(cè)供者淋巴細(xì)胞的增殖活性以及不同效靶比時(shí)供者淋巴細(xì)胞對(duì)受者PBMC和KG1a細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。 第三部分：TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig體外誘導(dǎo)供者T細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單相MLR后供者淋巴細(xì)胞中CD4+T、CD25+T、CD40L+T、CD8+T細(xì)胞的百分率，用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-labeledimmunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tms

11、forminggrowthfactorβ1，TGF-β1)、干擾素γ(interferonγ，INF-γ)和白細(xì)胞介素-4(interleukin，IL-4)的濃度，應(yīng)用基因掃描技術(shù)和RT-PCR分析T細(xì)胞克隆的變化和TCR基因重排調(diào)控蛋白mRNA的表達(dá)情況，以探討其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。 第四部分：TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig應(yīng)用對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)的影響 第一章 腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)同種異體外周血T細(xì)胞克隆增殖 常規(guī)

12、分離正常人PBMC6份，將人急性髓系白血病細(xì)胞KG1a和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251經(jīng)絲裂霉素C(mitomycin，MMC)處理(MMC處理組)或反復(fù)凍融制備成細(xì)胞溶解物L(fēng)ysate(Lysate組)后，進(jìn)行混合淋巴/月中瘤細(xì)胞培養(yǎng)(mixturelymphocyte/tumorcellcluture，MLTC)。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)、MTT還原法和乳酸脫氫酶(LDH)4小時(shí)釋放法分別檢測(cè)誘導(dǎo)后增殖T細(xì)胞免疫表型、增殖活性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活

13、性；分別應(yīng)用基因掃描技術(shù)和RT-PCR分析T細(xì)胞克隆的變化和TCR基因重排調(diào)控蛋白mRNA的表達(dá)情況。 第二章 TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig應(yīng)用對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)的影響 取上述單相MLR后的供者PBMC作為反應(yīng)細(xì)胞，加入KG1a細(xì)胞Lysate進(jìn)行5天MLTC。應(yīng)用MTT還原法、流式細(xì)胞技術(shù)和LDH釋放法分別檢測(cè)供者T細(xì)胞的增殖活性、免疫表型和對(duì)KG1a細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，同時(shí)應(yīng)用基因掃描技術(shù)和RT-PCR分析T細(xì)胞克

14、隆的變化和TCR基因重排調(diào)控蛋白mRNA的表達(dá)情況。 第五部分：?jiǎn)伪缎驮煅杉?xì)胞移植前后T細(xì)胞克隆變化的初步研究 選取2例進(jìn)行hap-HSCT的白血病患者，以供者、移植前后受者的PBMC為研究樣本，監(jiān)測(cè)TCRAV和TCRBV家族克隆表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，CDR3克隆性質(zhì)及測(cè)定各家族的利用率，觀察其與受者免疫功能重建和GVHD的關(guān)系。同時(shí)檢測(cè)供者NK細(xì)胞的KIR分型和受者的HLA基因型，觀察其與移植后患者生存狀況的關(guān)系。

15、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，以析因設(shè)計(jì)資料方差分析比較各組間的殺傷率和T細(xì)胞增殖抑制率的差異，以LSD與SNK法進(jìn)行組間比較。以單因素方差分析比較細(xì)胞因子濃度、T細(xì)胞增殖率、CD4+CD25+T細(xì)胞和CD40L+T細(xì)胞的百分率的差異，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P<0.05表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.基因掃描分析人TCRαβT細(xì)

16、胞CDR3基因型是一種簡(jiǎn)便、可靠、靈敏度高的T細(xì)胞克隆檢測(cè)技術(shù)，可用于腫瘤、造血干細(xì)胞移植、自身免疫性疾病等的T細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制方面的研究。 2.RT-PCR檢測(cè)NHEJ中的幾種主要調(diào)控蛋白R(shí)AG1、RAG2、Ku70、Ku80、TdTmRNA表達(dá)的方法穩(wěn)定、可靠，可作為研究TCR異常重排機(jī)制的技術(shù)平臺(tái)。 3.TJU103聯(lián)合CTLA4-Ig通過降低供者T淋巴細(xì)胞對(duì)受者正常組織抗原的增殖能力和細(xì)胞毒活性誘導(dǎo)移植免疫耐受，其不

17、影響供者淋巴細(xì)胞的抗白血病效應(yīng)。其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制可能與上調(diào)Th2細(xì)胞比率，阻斷CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞之間的協(xié)同效應(yīng)，誘導(dǎo)出免疫耐受的T細(xì)胞克隆有關(guān)。 4.腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞溶解物均可在體外誘導(dǎo)出同種異體特異性CTL，該CTL細(xì)胞可能為優(yōu)勢(shì)表達(dá)的對(duì)腫瘤應(yīng)答的TCRAV和TCRBV家族克隆T細(xì)胞。TJU103聯(lián)合CTLSA-Ig不影響供者淋巴細(xì)胞的抗白血病效應(yīng)。 5.T細(xì)胞克隆分析技術(shù)可以用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)allo-HS

18、CT后受者的免疫功能；還可以用于尋找介導(dǎo)GVHD和特殊感染的T細(xì)胞克隆。此外，供者KIR基因型和受者HIA基因型錯(cuò)配可以用于擇優(yōu)選擇合適的供者。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)： 1.在抗原存在的條件下，首次通過同時(shí)調(diào)節(jié)同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞活化的HLA/p-CD4和B7-CD28/CTLA4信號(hào)傳遞途徑誘導(dǎo)免疫耐受，并且不影響T細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。 2.首次從T細(xì)胞克隆和TCR二次重排角度認(rèn)識(shí)T細(xì)胞的免疫耐受和二次反應(yīng)