腦損傷后腸系膜靜脈注射同種異體MBP和自體腦細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的初步研究.pdf

1、目的：觀察顱腦損傷后經(jīng)腸系膜靜脈注射特定抗原免疫耐受建立的情況，初步探討肝臟非實質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制。
　　 方法：⑴選取新西蘭兔32只，隨機(jī)分成4組，每組8只，依次命名為A-D組，A組為單純顱腦損傷組，B組為注射1ml生理鹽水組，C組為注射1mlMBP(2mg/ml)組，D組為注射1ml腦組織單細(xì)胞懸液組(細(xì)胞密度為106/ml)。1d四組均開顱造模，取0.8*0.4*0.5cm腦組織制備單細(xì)胞懸液;制備好腦組織單細(xì)胞懸液

2、后在30min內(nèi)開腹尋找腸系膜靜脈，B組注射1ml生理鹽水。C、D組分別經(jīng)腸系膜靜脈分別注射1mlMBP和1ml單細(xì)胞懸液。7d全部處死，取損傷灶周圍腦組織做Fas/FasL的定量PCR。⑵選取20只SD大鼠，隨機(jī)分為3組，對照組5只、假手術(shù)組5只和損傷組10只，損傷組按傷后時間分為2、4、8、16h和24h5個采血點(diǎn)，在傷后不同時間點(diǎn)采用眼眶取血法，取靜脈血離心后得血清刺激原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后流式細(xì)胞儀測定小膠質(zhì)細(xì)

3、胞MHC-Ⅱ的表達(dá)。⑶另選取新西蘭兔24只，隨機(jī)分成3組，每組8只，依次命名為E-G組，E組為注射1ml生理鹽水組，F(xiàn)組為注射1mlMBP(2mg/ml)組，G組為注射1ml單細(xì)胞懸液組(細(xì)胞密度為106/ml)。手術(shù)腦損傷造模、注射抗原同第一部分。分別于術(shù)后1d、3d、5d、7d、14d和21d抽取靜脈血，做Elisa測血清中TGF-β、IL-2和IL-10的含量，21d處死，取肝臟組織做免疫熒光測定Foxp+3表達(dá)情況。
　　

4、 結(jié)果：①實時定量PCR顯示:損傷后7d單純顱腦損傷組和各處理組Fas均高表達(dá)，各組之間未見明顯差異（p＞0.05）;A、B兩組FasL未見表達(dá)增高，C組FasL表達(dá)顯著升高，與A、B兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05），D組表達(dá)略有升高，與A、B兩組比較未見統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。②流式細(xì)胞結(jié)果顯示:空白對照組MHC-Ⅱ微量表達(dá);假手術(shù)組有較低表達(dá);損傷組各個時間點(diǎn)均有表達(dá)，且隨著時間的推移，MHC-Ⅱ表達(dá)增高。損傷組與對照組兩

5、兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。③Elisa實驗顯示:與E組相比，F(xiàn)組TGF-β、IL-10顯著升高，于14d左右到達(dá)高峰，隨后緩慢下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），IL-2相應(yīng)減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）;G組TGF-β、IL-10于10-14d可見略有升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），IL-2未見明顯減低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。④免疫熒光化學(xué)顯示:在注射生理鹽水組和注射腦組織單細(xì)胞懸液組中

6、，肝臟石蠟切片中T淋巴細(xì)胞未看到明顯橙紅色激發(fā)光。在注射MBP組中可看到靜脈竇中和血管周圍T淋巴細(xì)胞中可見橙紅色熒光，說明注射MBP可使肝臟T淋巴細(xì)胞表達(dá)Foxp+3，與其他兩組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴各處理組中，F(xiàn)as在損傷后均高表達(dá)，說明損傷灶周圍有大量淋巴細(xì)胞聚集，炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈;經(jīng)腸系膜靜脈注射特定抗原并不能減少Fas的表達(dá)。腸系膜靜脈注射MBP可以誘導(dǎo)免疫耐受;注射腦組織單細(xì)胞懸液的抗原特異性

7、不高，不能完全誘導(dǎo)免疫耐受。⑵大鼠腦損傷后24h內(nèi)的血清可使小膠質(zhì)細(xì)胞MHC-Ⅱ的表達(dá)增高，小膠質(zhì)細(xì)胞MHC-Ⅱ表達(dá)隨著時間的推移不斷升高。從細(xì)胞水平支持了顱腦損傷早期炎癥反應(yīng)的劇烈程度。⑶經(jīng)腸系膜靜脈注射MBP后，可見與E組相比，顯著下降;而注射腦組織單細(xì)胞懸液組僅在14d才有下降，表明注射MBP可以誘導(dǎo)免疫耐受，而后者抗原特異性較差。⑷TGF-β、IL-10均是強(qiáng)效免疫抑制因子，它們可以抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，抑制T,B