T細(xì)胞來源Exosomes調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠外周T細(xì)胞功能誘導(dǎo)母胎免疫耐受的研究.pdf

1、目的:反復(fù)妊娠丟失指自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生3次或3次以上者，其發(fā)生率約占自然流產(chǎn)病例的3％-5％，但仍有50％-60％原因不明，稱為不明原因反復(fù)妊娠丟失(URSA)，嚴(yán)重影響著孕婦的身心健康。隨著生殖免疫醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究表明URSA主要與免疫因素有關(guān)，是母體對胎兒免疫排斥的結(jié)果。妊娠是一種同種異體移植，胚胎被母體的免疫機(jī)制識別并接納后，妊娠才能得以正常維持。因此，誘導(dǎo)母體對同種異體胎兒抗原的免疫耐受是治療的關(guān)鍵。
　　 國內(nèi)外研究表明

2、當(dāng)前臨床多采用免疫細(xì)胞過繼療法治療URSA，誘導(dǎo)母體對同種異體胚兒抗原的免疫耐受，但是這種方法存在較多的局限性。本研究采用流產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動物模型，分析T細(xì)胞來源的非細(xì)胞成分Exosomes調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠外周T細(xì)胞功能以誘導(dǎo)母胎免疫耐受，確定分析T細(xì)胞來源Exosomes取代傳統(tǒng)“免疫細(xì)胞過繼療法”治療妊娠丟失的免疫學(xué)機(jī)制，為今后開展臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)并提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、雄性無關(guān)個體脾細(xì)胞及其Exoso

3、mes的制備和初步鑒定:斷頸處死BALB/c雄鼠，無菌條件下解剖取脾組織，獲得單個細(xì)胞懸液，采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾技術(shù)獲得Exosomes;通過掃描電鏡、透射電鏡觀察Exosomes的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，紫外分光光度法測定其蛋白含量。
　　 2、妊娠丟失實(shí)驗(yàn)動物模型的建立:雌雄小鼠隨機(jī)分為4組后按2∶1合籠交配;CBA/J(♀)×BALB/c（(♂)）為正常妊娠對照組(Contro組)，CBA/J(♀)×DBA/2((♂))為UR

4、SA組。再將URSA孕鼠分別于孕第4天無特殊處理，給予尾靜脈注射無關(guān)個體BALB/c雄鼠脾單個核細(xì)胞及無關(guān)個體BALB/c雄鼠脾T細(xì)胞來源的Exosomes，隨機(jī)分為妊娠丟失組(URSA組)、細(xì)胞治療組(Cellular Therapy組)、非細(xì)胞治療組(Non-cellular Therapy組)。
　　 3、胚胎發(fā)育情況的觀察:于妊娠第14天分別將各組CBA/J孕鼠處死，測量計算胎盤體積，計數(shù)各組吸收胚胎個數(shù)及存活胚胎個數(shù)，

5、根據(jù)公式計算出胚胎吸收率及妊娠丟失率。
　　 4、母胎免疫耐受狀況的分析:于妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取脾組織，制備單個脾細(xì)胞懸液。MTT染色法檢測單向混合淋巴反應(yīng)、雙向混合淋巴反應(yīng)中T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的A492值。
　　 5、孕鼠外周T淋巴細(xì)胞免疫功能變化的檢測:于妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取脾組織，制備單個脾細(xì)胞懸液。直接熒光標(biāo)記流式細(xì)胞計數(shù)(FCM)分別檢測T細(xì)胞表面CD3、CD

6、4、CD8、CD247、CD25、IL-17、CD28、CTLA-4的表達(dá)，分別計算CD3+、CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD3+CD247+、 CD4+CD25+、IL-17+、 CD4+CD28+、CD4+CTLA-4+細(xì)胞的百分率。
　　 6、統(tǒng)計學(xué)處理:各組數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0版本軟件進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，采用卡方檢驗(yàn)比較各組孕鼠胚胎發(fā)育情況;采用F檢驗(yàn)對孕鼠T細(xì)胞免疫功能進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA

7、)，S-N-K法進(jìn)一步對多個樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較。
　　 結(jié)果:
　　 1、雄性無關(guān)個體脾臟T細(xì)胞來源Exosomes的初步鑒定
　　 形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察及蛋白定量。掃描及透射電鏡下觀察，T細(xì)胞分泌的Exosomes為脂質(zhì)雙分子層膜包圍的球體，呈橢圓形或圓形杯口狀，胞膜完整，直徑約為30nm～100nm，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)。紫外分光光度法蛋白定量顯示Exosomes的A280值為0.343±0.029。

8、　　 2、不同過繼轉(zhuǎn)輸對妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響
　　 Control組孕鼠的胚胎吸收率為5.25％，URSA組為20.78％，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組分別為7.81％、3.18％。與URSA組相比，細(xì)胞治療組及非細(xì)胞治療組胚胎吸收率均顯著下降(均P＜0.01)，并且均下降至Control組水平（均P＞0.05）;非細(xì)胞治療組胚胎吸收率顯著低于細(xì)胞治療組(P＜0.05）。
　　 Control組孕鼠的妊娠丟失率為20

9、％，URSA組為62％，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組分別為22％、22％。與URSA組相比，細(xì)胞治療組及非細(xì)胞治療組妊娠丟失率均顯著下降(均P＜0.01)，且均下降至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 3、母胎免疫耐受狀況的分析
　　 單向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，Control組、URSA組及細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組孕鼠脾細(xì)胞的A492值(分別為0.584±0.060、0.6

10、97±0.035，0.411±0.024、0.313±0.191)。其中，Control組與URSA組之間明顯差異(P＜0.05);細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組較之顯著下降(均P＜0.05)，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組無明顯差異(P＞0.05）。
　　 雙向淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)，Control組、URSA組及細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組孕鼠脾細(xì)胞的A492值(分別為0.551±0.308、0.478±0.116，0.702±0.126、0.5

11、63±0.134)。其中，Control組與URSA組之間有明顯差異（P＜0.05）;細(xì)胞治療組較之顯著上升（P＜0.05），非細(xì)胞治療組較之無明顯差異(P＞0.05)，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組有明顯差異（P＜0.05）。
　　 4、外周T淋巴細(xì)胞功能的檢測
　　 4.1、CD4、CD8的表達(dá)變化
　　 與Control組外周T細(xì)胞CD3表達(dá)百分率(33.47％±11.78％)相比，URSA組表達(dá)百分率顯著升高(

12、43.43％±5.41％，P＜0.01);經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后無明顯變化（分別為42.17％±7.43％，41.62％±7.21％，P＞0.05），兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 與Control組外周T細(xì)胞CD4+CD8-表達(dá)百分率(23.09％±3.02％)相比，URSA組表達(dá)百分率顯著升高(29.02％±5.74％，P＜0.01);經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著降低(分別為20.25％±7.70

13、％、22.86％±8.98％，均P＜0.01)至Control組水平(均P＞0.05);兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 與Control組外周T細(xì)胞CD4-CD8+表達(dá)百分率（30.64％±1.55％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著降低(27.24％±1.70％，P＜0.01);經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著升高(分別為32.45％±2.12％、31.72％±0.98％，均P＜0.01)至Control組

14、水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 與Control組外周T細(xì)胞CD4/CD8表達(dá)百分率（1.04％±0.21％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著升高（1.50％±0.63％，P＜0.01）;經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著降低(分別為1.06％±0.11％、1.06％±0.29％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。

15、
　　 4.2、CD3+CD247+的表達(dá)變化
　　 與Control組外周T細(xì)胞CD3+CD247+表達(dá)百分率(3.77％±1.79％)相比，URSA組表達(dá)百分率顯著降低（0.13％±0.06％，P＜0.01）;經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著升高(分別為3.30％±0.99％、3.57％±0.78％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　

16、 4.3、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)變化
　　 與Control組外周T細(xì)胞CD4+CD25+表達(dá)百分率（1.68％±0.75％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著升高(1.26％±0.85％，P＜0.01);經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著降低(分別為2.00％±0.89％、2.10％±0.70％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 與Control組外周

17、T細(xì)胞IL-17+表達(dá)百分率(2.49％±0.14％)相比，URSA組表達(dá)百分率顯著升高(1.21％±0.11％，P＜0.01);經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著降低(分別為2.24％±0.52％、2.38％±1.02％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4.4、正負(fù)向協(xié)同刺激因子細(xì)胞表達(dá)的變化
　　 與Control組脾細(xì)胞CD4+CD28+

18、表達(dá)百分率（4.91％±1.21％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著下調(diào)（1.73％±0.84％，P＜0.01）;經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著升高(分別為4.05％±1.23％、4.12％±1.28％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 與Control組脾細(xì)胞CD4+CTLA-4+表達(dá)百分率（0.82％±0.08％）相比，URSA組表達(dá)百分率顯著升高

19、（3.08％±0.37％，P＜0.01）;經(jīng)細(xì)胞治療、非細(xì)胞治療后顯著降低(分別為0.77％±0.11％、1.20％±0.30％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、過繼轉(zhuǎn)輸雄性個體外周T淋巴細(xì)胞或其分泌的非細(xì)胞成分Exosomes均可有效誘導(dǎo)母胎免疫耐受，過繼轉(zhuǎn)輸Exosomes可發(fā)揮更強(qiáng)的母胎免疫耐受誘導(dǎo)效應(yīng)。