肺癌患者腫瘤區(qū)域引流淋巴結(jié)細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究TDLN細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤作用，初步探討TDLN細(xì)胞的作用機(jī)理，改良TDLN細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為腫瘤特異性生物治療提供新思路。 方法：1肺癌患者TDLN細(xì)胞懸液的制備。 2肺癌組織單細(xì)胞懸液的制備。 3肺癌細(xì)胞抗原制備。 4TDLN細(xì)胞的活化：將患者TDLN細(xì)胞懸液(1×106/ml)加入24孔板中(1ml/孔)，分為三組，分別加入不同的刺激物。第一組加入IL-2(175U/ml)；第二組加入IL-

2、2(175U/ml)+自身tAg(50μg/ml)；第三組加入IL-2(175U/ml)+GM-CSF(500U/ml)+IL-4(100U/ml)+自身tAg(50μg/ml)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 5TDLN細(xì)胞的異倍體檢測(cè)。 6TDLN細(xì)胞的免疫表型分析：經(jīng)過(guò)活化的TDLN細(xì)胞培養(yǎng)14天后加入FITC-anti-CD83、FITC-CD3/PE-CD56和FITC-CD4/PE-CD8單克隆抗體，室溫

3、孵育30min，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀分析。 7細(xì)胞因子檢測(cè)：調(diào)整TDLN細(xì)胞濃度至2×105/ml，加入24孔板中(1ml/孔)，分為三組，第一組加入IL-2(175U/ml)；第二組加入IL-2(175U/ml)+自身tAg(50μg/ml)；第三組加入IL-2(175U/ml)+GM-CSF(500U/ml)+IL-4(100U/ml)+自身tAg(50μg/ml)。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液一次。分

4、別收集培養(yǎng)至第7、14、21天的培養(yǎng)上清。用ELISA法檢測(cè)IL-12p70、IFN-γ和TNF-α的含量。用Griess法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的NO的含量。 8TDLN細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)：經(jīng)不同刺激物活化的TDLN效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)14天后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml。利用乳酸脫氫酶法檢測(cè)其對(duì)自體肺癌細(xì)胞的殺傷情況。 9TDLN細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤作用檢測(cè)：采用皮下埋塊法建立荷瘤裸鼠模型，分別注射IL-2刺激的TDLN細(xì)胞、IL-2+

5、自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞、IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞和單獨(dú)注射IL-2。計(jì)算各組裸鼠瘤體體積，繪制生長(zhǎng)曲線。 10組織學(xué)檢查：收集各組裸鼠的腫瘤組織，用4％多聚甲醛固定后切片，進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡下觀察。 12應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組裸鼠腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡情況以及凋亡基因相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：1從1g腫瘤區(qū)域引流淋巴結(jié)組織中可以獲得約1×108個(gè)TDLN細(xì)胞，經(jīng)14

6、天培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)目可以增加一倍。 2經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)分析，培養(yǎng)后的TDLN細(xì)胞中無(wú)異倍體細(xì)胞存在。 3經(jīng)IL-2，IL-2+自身tAg，IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞中CD3陽(yáng)性的細(xì)胞比率分別為：(81.83±5.56)％，(80.20±4.16)％，(83.20±3.34)％；CD56陽(yáng)性的細(xì)胞比率分別為：(8.72±3.02)％，(9.19±2.73)％，(9.44±2.90)％；CD4陽(yáng)

7、性的細(xì)胞比率分別為：(50.41±4.29)％，(47.67±2.42)％，(42.87±4.75)％；CD8陽(yáng)性的細(xì)胞比率分別為：(31.39±5.02)％，(30.57±3.59)％，(39.44±2.57)％；CD83陽(yáng)性的細(xì)胞比率分別為：(20.40±4.92)％，(24.50±4.33)％，(30.87±2.25)％。 4IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞與IL-2/IL-2+自身tAg刺激

8、組相比，分泌IL-12p70、IFN-γ和TNF-o的水平明顯增高，有顯著性差異(P＜0.01)。三個(gè)刺激組分泌的NO水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 5經(jīng)IL-2，IL-2+自身tAg，IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞對(duì)自身肺癌細(xì)胞的特異性殺傷率分別為：(41.67±6.28)％，(57.76±9.51)％，(70.78±6.06)％，三組間TDLN細(xì)胞的殺傷率有明顯差異(P＜0.05)。IL-

9、2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞與IL-2/IL-2+自身tAg刺激組相比，對(duì)肺癌細(xì)胞的特異性殺傷率明顯增高(P＜0.05)。 6荷瘤裸鼠經(jīng)不同方法治療后腫瘤的生長(zhǎng)情況與生理鹽水處理的對(duì)照組荷瘤裸鼠相比，從第二周開(kāi)始單獨(dú)使用IL-2治療和不同刺激劑誘導(dǎo)TDLN細(xì)胞治療的荷瘤裸鼠可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)(P＜0.05)。從第三周開(kāi)始，應(yīng)用三種刺激劑誘導(dǎo)TDLN細(xì)胞的治療作用比單獨(dú)使用IL-2更加明顯(P＜0.0

10、1)；不同誘導(dǎo)劑之間的抑瘤作用也存在一定的差異(P＜0.05)，其中以IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg誘導(dǎo)TDLN細(xì)胞的抑瘤效果最強(qiáng)。 7經(jīng)不同方法治療后，腫瘤組織細(xì)胞的凋亡情況對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行不同方法的治療，如注射生理鹽水、注射IL-2、注射IL-2刺激TDLN細(xì)胞、注射IL-2+自身tAg刺激TDLN細(xì)胞、注射IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞等，治療后腫瘤組織細(xì)胞發(fā)生了不同程度的凋亡現(xiàn)

11、象，細(xì)胞的凋亡率分別為：(7.07±3.31)％、(12.41±1.19)％、(22.30±2.83)％、(23.62±1.90)％、(33.06±4.46)％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，生理鹽水處理組和注射IL-2組荷瘤裸鼠的腫瘤凋亡率之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，明顯低于三種刺激劑誘導(dǎo)的TDLN細(xì)胞治療組的腫瘤凋亡率(P＜0.01)。三種刺激劑誘導(dǎo)的TDLN細(xì)胞治療組中，以IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞誘導(dǎo)

12、腫瘤組織的凋亡率最高(P＜0.01)。 8凋亡基因相關(guān)蛋白的表達(dá)情況對(duì)荷瘤裸鼠經(jīng)不同方法治療，如注射生理鹽水、IL-2組、IL-2刺激TDLN細(xì)胞、注射IL-2+自身tAg刺激TDLN細(xì)胞以及注射IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞等方法治療后，腫瘤組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax、survivin的表達(dá)量存在明顯差異(P＜0.01)。注射IL-2刺激的TDLN細(xì)胞組、IL-2+自身tAg刺激的

13、TDLN細(xì)胞組、IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞組的腫瘤組織較注射生理鹽水組和單獨(dú)注射IL-2組的腫瘤組織bax的表達(dá)明顯增高(P＜0.01)；bcl-2和survivin的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。其中以IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞組最明顯。各組腫瘤組織表達(dá)凋亡基因相關(guān)蛋白Fas和FasL的量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1TDLN細(xì)胞在體外和體內(nèi)均

14、具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。 2經(jīng)不同刺激物活化后的TDLN細(xì)胞，抗腫瘤作用有很大差異，其中經(jīng)IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞的抗腫瘤作用最強(qiáng)。經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細(xì)胞中含有的CD83陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于IL-2刺激組和IL-2+自身tAg刺激組。由于CD83是成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的表面標(biāo)志，所以樹(shù)突狀細(xì)胞可能在TDLN效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用中起到了十分關(guān)