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文檔簡介
1、研究背景:中性粒細胞即多形核細胞(polymorphonuclear cells, PMNs)是機體承擔固有免疫的主要細胞之一,構(gòu)成了免疫防御機制的第一道防線。PMN防御系統(tǒng)中最重要的一個環(huán)節(jié)是通過呼吸氧爆發(fā)過程中產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)即ROS爆發(fā),其細胞內(nèi)抑菌殺菌作用與NADPH氧化酶介導產(chǎn)生ROS直接相關(guān)。目前有研究發(fā)現(xiàn),機體抗結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tubercul
2、osis, Mtb)感染的過程中,PMN起著重要的免疫保護作用,有證據(jù)顯示PMN吞噬Mtb后通過釋放ROS達到殺死Mtb的目的,但其機制卻不明確。探討Mtb誘導PMN活性氧爆發(fā)機制,在抗結(jié)核感染的天然免疫作用,對于全面了解機體抗結(jié)核感染的免疫保護機制,具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。
目的:建立流式細胞術(shù)檢測人外周血PMN感染Mtb時ROS產(chǎn)生;觀察不同的信號阻斷劑對PMN感染Mtb時ROS產(chǎn)生的影響,了解所涉及信號通路。<
3、br> 方法:
1.取健康人外周血標本加入雙氫羅丹明(DHR)或2′,7′二氯二氫熒光素二酯酸(DCFH-DA)37℃孵育15 min后,分別再加佛波醇酯(Phorbo12-myristate13-acetate, PMA)、Mtb、大腸埃希菌(Ecoli)混勻,置37℃水浴5~90 min,經(jīng)溶血和洗滌后,PBS重懸,流式細胞術(shù)檢測PMN內(nèi)的羅丹明123(rhodamine123, RHO)或氧化型二氯熒光素(dichlo
4、rofluorecin, DCF)的熒光強度。
2.取健康人外周血用Percoll分離獲得PMN,加DHR或DCFH-DA37℃孵育15 min后,分別與PMA、Mtb、Ecoli混勻,置37℃水浴5~90 min,流式細胞術(shù)檢測PMN內(nèi)RHO或DCF的熒光強度。
3.取健康人外周血和DHR37℃孵育15 min后,與PMA相混合,置37℃水浴5~90 min,溶血和洗滌,分別用磷酸鹽緩沖液(PBS, pH7.2)、
5、1%甲醛重懸、1%多聚甲醛(Paraformaldehyde,1%PFA)重懸,流式細胞術(shù)檢測PMN內(nèi)RHO的熒光強度。
4.取健康人外周血預(yù)先分別加ERK1/2阻斷劑U0126、MAPKp38阻斷劑SB203580或PKC阻斷劑GF109203x孵育30 min,再加DHR37℃孵育15 min,然后分別再加PMA、Mtb、Ecoli混勻,置37℃水浴。30 min對PMA刺激組進行溶血和洗滌,PBS重懸;60 min對Mt
6、b、Ecoli刺激組進行溶血和洗滌,PBS重懸,流式細胞術(shù)檢測PMN內(nèi)RHO的熒光強度,并與對照組比較RHO的熒光強度變化情況。
結(jié)果:
1.以DHR為熒光探針時,全血標本或分離PMN經(jīng)PMA刺激后產(chǎn)生ROS的時間動力學相似,在37℃作用5~60 min時ROS量呈遞增趨勢,且在60 min左右達到峰值,60~90 min時漸下降。分離PMN比刺激全血標本產(chǎn)生ROS峰值高。以DHR為熒光探針時,Mtb、Ecoli刺激
7、全血或分離PMN產(chǎn)生ROS的時間動力學相似,在37℃作用5~90 min時ROS量呈遞增趨勢。
2.以DCFH-DA為熒光探針時,PMA、Mtb、Ecoli刺激全血PMN產(chǎn)生ROS的時間動力學相似,在37℃作用5 min時ROS量達到峰值,隨后出現(xiàn)明顯遞減趨勢,而PMA刺激分離PMN產(chǎn)生ROS量在5~30 min時逐漸增高并在60~90 min時達平臺期,Mtb、Ecoli刺激分離PMN產(chǎn)生ROS在5~90 min時逐漸增高。
8、
3.人外周血與PMA在37℃水浴作用不同時間段,與PBS重懸組比較,1%甲醛、1%PFA均可顯著降低胞內(nèi)RHO的熒光強度,兩者之間的差別有統(tǒng)計學意義。
4. ERK1/2阻斷劑U0126、MAPKp38阻斷劑SB203580和PKC阻斷劑GF109203x均可降低PMA、Mtb、Ecoli刺激PMN的RHO熒光強度。
結(jié)論:
1.用流式細胞術(shù)檢測PMN呼吸爆發(fā)時ROS產(chǎn)生,熒光探針DHR比DCF
9、H-DA更穩(wěn)定、敏感。
2. DHR探針檢測PMN呼吸爆發(fā)時ROS產(chǎn)生,全血標本與分離PMN標本的檢測結(jié)果相似,但PMA刺激分離PMN的ROS峰值明顯高于全血標本。DCFH探針檢測Mtb、Ecoli刺激全血標本時,PMN產(chǎn)生ROS的動力學與PMA刺激時相似。
3. Mtb刺激比Ecoli刺激PMN產(chǎn)生更多ROS,提示Mtb激活PMN產(chǎn)生更多的殺菌活性物質(zhì)。
4.含甲醛的試劑對PMN的ROS產(chǎn)生有明顯降低作用
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