β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ在胚胎著床中的作用及與白血病抑制因子的相互調(diào)控.pdf

1、目的： 白血病抑制因子(LIF)因其能誘導(dǎo)小鼠M1型白血病細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞和抑制白血病細(xì)胞增殖而得名，是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)功能的分泌型糖蛋白，是介導(dǎo)胚泡著床最主要的細(xì)胞因子。LIF在胚胎的生長(zhǎng)、發(fā)育及分化中起重要作用。許多研究表明：含LIF的條件培養(yǎng)液可促進(jìn)胚胎發(fā)育、加速孵化、提高其存活率、以及促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)、加速胚胎脫透明帶。已知LIF對(duì)著床網(wǎng)絡(luò)中的多種因子(如基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs、表皮生長(zhǎng)因子EGF等

2、)均有調(diào)節(jié)作用，但其對(duì)參與精卵識(shí)別的細(xì)胞黏附分子β1，4-GalT Ⅰ是否參與胚胎著床及其在著床中的作用尚不清楚。 β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(β1，4-galactosyltransferase Ⅰ，β1，4-GalT Ⅰ)是目前人們研究最廣泛的糖基轉(zhuǎn)移酶之一，它是β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族中最早被發(fā)現(xiàn)的，也是研究最深入的一個(gè)成員。β1 ，4-GalT Ⅰ以長(zhǎng)型和短型的形式分布在高爾基體和細(xì)胞膜兩種不i司的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，行使

3、不同的功能。高爾基體上的β1，4-GalT Ⅰ功能是將半乳糖基從UDP-半乳糖基轉(zhuǎn)移到N-糖鏈的末端N-乙酰氨基葡萄糖上形成β1，4-糖苷鍵：細(xì)胞膜上的β1，4-GalT Ⅰ作為細(xì)胞黏附分子參與了一系列生理過(guò)程，例如細(xì)胞的黏附、鋪展、精卵識(shí)別、神經(jīng)軸突的延伸、間充質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的遷移以及晚期桑椹胚的致密化。而胚胎著床與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)有很多相似之處。本文利用人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(RL95-2，模擬著床前子宮內(nèi)膜)和人胚胎細(xì)胞(JAR

4、、模擬著床前胚胎)組成的體外著床模型，采用RNAi干涉(或過(guò)表達(dá))、RT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)染色及Dot-blot等方法研究LIF與β1，4-GalT Ⅰ之間的相互調(diào)控及其對(duì)胚胎著床的影響。 方法： 人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(RL95-2)經(jīng)含LIF或LIFAb培養(yǎng)基培 1養(yǎng)，或經(jīng)β1，4-GalT I基因干擾(或過(guò)表達(dá))載體轉(zhuǎn)染后，應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色、RT-PCR和Dot-blot方法，分析LIF對(duì)β1，4-GalT I

5、表達(dá)的影響，或調(diào)控β1，4-GalT I基因表達(dá)后對(duì)LIF表達(dá)的影響，并通過(guò)體外著床模型分別觀察LIF及β1，4-GalT I對(duì)胚胎著床的作用。 結(jié)果： (1)與正常培養(yǎng)組相比，在經(jīng)LIF培養(yǎng)24h后，RL95-2細(xì)胞的Gal β1-4GleNAc合成量增加;β1．4-GalT I的基因表達(dá)水平增高；β1，4-GalT I酶蛋白水平提高。同時(shí)，胚胎的黏附率(83.5％)也明顯高于正常培養(yǎng)組(70％)。而經(jīng)LIFAb處理2

6、4h后，Gal β1-4GlcNAc的合成量下降；β1，4-GalT I基因的表達(dá)水平降低; β1，4-GalT I酶蛋白的合成水平減少。同時(shí)，胚胎的黏附率(35％)也明顯低于正常培養(yǎng)組(70％)。(p<0.05) (2)在β1，4-GalT I基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入后60h，RL95-2細(xì)胞內(nèi)有明顯的綠色熒光蛋白表達(dá)，說(shuō)明載體轉(zhuǎn)染效果良好。與正常培養(yǎng)組和空載體轉(zhuǎn)染組比較，基因干擾組Gal β1 -4GlcNAc的合成明顯下降；過(guò)表達(dá)

7、組則明顯增高。同時(shí)觀察β1，4-GalT I基因過(guò)表達(dá)組，其LIF基因和蛋白的表達(dá)增高，胚胎的黏附率和擴(kuò)展生長(zhǎng)率(84.5％)高于正常培養(yǎng)組(70.0％)、空載體組(68.4％)和基因干擾對(duì)照組(67.6％)，(p<0.05)；而β1,4-GalT I基因抑制組，LIF基因及其蛋白表達(dá)均下降，胚胎的黏附率和擴(kuò)展生長(zhǎng)率(29.2％)也明顯降低，(p<0.05)。 結(jié)論： (1) RL95-2細(xì)胞的LIF與β1，4-GalT