SUV39H1-H2基因表達(dá)抑制對(duì)豬體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育潛能影響的初步研究.pdf

1、體細(xì)胞克隆效率主要取決于供體細(xì)胞核是否被完全重編程，而供體細(xì)胞重編程涉及去除表觀遺傳標(biāo)記，將其逆轉(zhuǎn)為未分化的狀態(tài)，獲得可重新分化成各種類型細(xì)胞的能力[1]。組蛋白3第9位賴氨酸三甲基化(H3K9me3)依賴的異染色質(zhì)是體細(xì)胞發(fā)生完全重編程的重大障礙[2]。花斑抑制因子同源物(suppressor of variegation3-9 homolog1/2，SUV39H1/2)基因編碼特異性催化H3K9me3形成的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)染

2、色質(zhì)濃縮形成異染色質(zhì)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。為了探究SUV39H1/H2基因在體細(xì)胞重編程過程中的作用，本研究采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制德保豬耳成纖維細(xì)胞SUV39H1/H2基因表達(dá)，并以之為核供體，探究對(duì)豬體細(xì)胞核移植早期胚胎發(fā)育潛能的影響。以探索提高克隆胚胎發(fā)育潛能及克隆動(dòng)物生產(chǎn)效率新途徑。
　　一、 SUV39H1/H2基因表達(dá)載體構(gòu)建及其shRNA干擾效率驗(yàn)證
　　1.為了獲得具有顯著抑制SUV39H1/H2基因表達(dá)

3、的shRNA片段，本試驗(yàn)首先克隆獲得德保豬SUV39H1基因第二外顯子和SUV39H2基因完整的ORF序列，分別構(gòu)建其真核表達(dá)載體并在293T細(xì)胞中表達(dá);SUV39H1基因第二外顯子序列與野豬SUV39H1基因具有100％同源性，且在牛、綿羊、馬等物種中保持較高的序列同源性;SUV39H2基因編碼的氨基酸序列與牛、人和黑猩猩相比，同源性分別為97％、96％和96％，說(shuō)明SUV39H2蛋白在不同物種之間表現(xiàn)出較高的保守性。
　　2.

4、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的SUV39H1/H2基因siRNA序列，分別構(gòu)建其相應(yīng)的pSicoR-GFP-shRNA慢病毒表達(dá)載體。將靶基因表達(dá)載體與相應(yīng)的干擾載體按照1∶3的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用qRT-PCR方法分析比較shRNA的干擾效率。結(jié)果顯示，SUV39H1-shRNA1/2對(duì)SUV39H1基因的抑制效果顯著(P＜0.05)，分別為65.08％、40.11％。SUV39H2-shRNA1/2對(duì)SUV39H2基因的抑制效果亦顯著(P

5、＜0.05)，分別是39.29％、93.59％。選擇SUV39H1-shRNA1和SUV39H2-shRNA2進(jìn)行后續(xù)研究。
　　二、SUV39H1/H2基因表達(dá)抑制對(duì)豬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　為了探究SUV39H1/H2基因表達(dá)抑制對(duì)豬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，利用脂質(zhì)體法分別包裝SUV39H1/H2基因shRNA慢病毒，將兩種病毒以滴度比為1∶1混合，以不同MOI值(300/600/1200)的病毒感染德保豬耳成纖維細(xì)胞，

6、測(cè)定各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;收集MOI600病毒感染組細(xì)胞，采用qRT-PCR方法分析相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與未處理組相比，MOI300和600病毒感染可以明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)(P＜0.05);MOI1200組細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖速度也較另外兩個(gè)感染組緩慢。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在MOI600病毒感染組細(xì)胞中，SUV39H1/H2基因的抑制程度分別為64.18％、59.28％，G9A、HDAC1、DNMT1基因的表

7、達(dá)顯著降低（P＜0.05），HAT1基因表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinA2、CyclinB、PCNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，CyclinD1、CyclinD2基因的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。
　　三、 SUV39H1/H2基因表達(dá)抑制對(duì)豬體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育的影響
　　1.利用免疫組化方法分析了H3K9me3在豬早期胚胎中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，豬孤雌激活和核移植早期發(fā)育胚胎（PA和SCN

8、T）的各個(gè)時(shí)期均能檢測(cè)到H3K9me3表達(dá)，但表達(dá)趨勢(shì)不同。H3K9me3水平在PA胚胎1-細(xì)胞期至8-細(xì)胞期升高，8-細(xì)胞期達(dá)到最高水平，之后又下降;SCNT胚胎H3K9me3的水平除了在2-細(xì)胞期至4-細(xì)胞期有所下降以外，在1-細(xì)胞期至桑椹胚期總體呈升高趨勢(shì)，桑椹胚期至囊胚期下降。
　　2.采用qRT-PCR方法分析調(diào)控H3K9me3表達(dá)相關(guān)酶基因在豬早期胚胎中的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCNT組胚胎的SUV39H1/H2、KDM

9、4D基因表達(dá)水平均高于PA組，且在2-細(xì)胞期胚胎的表達(dá)水平均極顯著升高(P＜0.01);SCNT組的SETDB1基因表達(dá)水平在2-細(xì)胞期胚胎與PA組差異不顯著（P＞0.05），在4-細(xì)胞期至囊胚期胚胎顯著高于PA組(P＜0.05)。
　　3.以MOI300和600的病毒感染豬成纖維細(xì)胞，挑選表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞進(jìn)行核移植試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)胚胎分裂率、囊胚率、囊胚平均細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果顯示，與未處理組相比，SUV39H1/H2基因表達(dá)抑制能夠

10、顯著提高豬核移植胚胎的分裂率、囊胚率和囊胚平均細(xì)胞總數(shù)(P＜0.05)。比較兩個(gè)病毒感染組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著SUV39H1/H2基因表達(dá)抑制程度的增加，表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)目增多，核移植胚胎的囊胚率顯著升高(P＜0.05)，胚胎分裂率、囊胚平均細(xì)胞總數(shù)沒有顯著變化(P＞0.05)。
　　以上研究結(jié)構(gòu)表明，在一定程度上，抑制SUV39H1/H2基因的表達(dá)能夠促進(jìn)德保豬耳成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高豬核移植胚胎分裂率和囊胚率，增加囊胚平均細(xì)胞總