核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)基因C20orf54多態(tài)變異與食管癌高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn).pdf

1、1、研究背景和目的
　　 食管癌是世界上最常見(jiàn)的六大惡性腫瘤之一。中國(guó)，尤其是河南、河北和山西三省交界的太行山地區(qū)，是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一。明顯的家族聚集現(xiàn)象是食管癌流行病學(xué)的突出特征之一。顯著的地域性分布差異和明顯的家族聚集現(xiàn)象提示環(huán)境和遺傳因素在食管癌發(fā)生中可能起重要作用。近年的研究提示，遺傳和環(huán)境因素交互作用可能是導(dǎo)致食管癌變的重要機(jī)制。但由于缺乏對(duì)人群大樣本遺傳變異檢測(cè)的高通量技術(shù)，有關(guān)遺傳變異和食管

2、癌變關(guān)系尚不十分清楚。
　　 2007年問(wèn)世的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GenomeWideAssociationStudy,GWAS)技術(shù)很快被應(yīng)用于惡性腫瘤等許多復(fù)雜性疾病易感基因的定位研究。并被認(rèn)為是目前確定復(fù)雜性疾病遺傳易感基因最有效的方法之一。GWAS技術(shù)的特點(diǎn)是高通量遺傳變異檢測(cè)（一次可檢測(cè)50-100萬(wàn)個(gè)SNPs，SingleNucleitidePolymorphism）和強(qiáng)大的統(tǒng)計(jì)分析功能。
　　 本課題組利用G

3、WAS技術(shù)進(jìn)行中國(guó)人群食管癌易感基因定位研究，發(fā)現(xiàn)C20orf54（又稱(chēng)核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)基因，humanriboflavintransporter2，hFRT2）基因是食管癌重要的易感基因之一。hFRT2位于20號(hào)染色體，編碼人核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2，細(xì)胞系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示C20orf54的作用是將核黃素從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)。老一代科學(xué)家對(duì)河南食管癌高發(fā)區(qū)的研究已證實(shí)核黃素缺乏是食管癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一。膳食補(bǔ)充核黃素能明顯降低食管癌的患病風(fēng)

4、險(xiǎn)。但是膳食補(bǔ)充核黃素所引起的干預(yù)效果存在明顯的個(gè)體差異。C20orf54的變化可能在一定程度上解釋了這種個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。如果C20orf54基因變異，失去這種轉(zhuǎn)運(yùn)功能，即使補(bǔ)充核黃素也因?yàn)椴荒苡行нM(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而失去干預(yù)的效果。很顯然，進(jìn)一步了解C20orf54基因的變化特征及其與核黃素水平關(guān)系，對(duì)揭示環(huán)境和遺傳因素交互作用對(duì)食管癌變影響的分子基礎(chǔ)和個(gè)體化防治等具有重要意義。
　　 SNP是指在基因組水平上因單個(gè)核苷酸變異而引

5、起的DNA序列多態(tài)性，是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。位于基因編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP，cSNP)較少，但它在與遺傳有關(guān)疾病的研究中具有重大意義。本研究組食管癌GWAS研究確定C20orf54基因上一個(gè)重要SNP位點(diǎn)，這是一個(gè)重要的標(biāo)簽，提示該位點(diǎn)前后可能還存在其他與核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的變異位點(diǎn)。進(jìn)一步對(duì)這一基因區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序?qū)﹃U明C20orf54基因不同變異類(lèi)型具有重要意義。
　　 需要指出的是，移民流行病學(xué)研究可

6、能是揭示環(huán)境和遺傳因素交互作用對(duì)食管癌發(fā)生影響的最佳模型之一。本研究組對(duì)河南食管癌高發(fā)區(qū)林州遷徙居民（＞100年）病理流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)這些移民食管癌發(fā)病率與遷徙地居民相似。因此，對(duì)比分析這些遷徙居民與當(dāng)?shù)鼐用窈它S素水平及C20orf54基因變異對(duì)進(jìn)一步確立食管癌個(gè)體化防治新的研究思路和方向等具有重要意義。
　　 本研究在前期工作基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)長(zhǎng)治地區(qū)正常人群、食管癌人群和長(zhǎng)治林州移民血漿中核黃素水平及下常食管黏膜組織和鱗癌組織

7、中核黃素水平，研究C20orf54基因中SNPs(rs3746804，rs3746803，rs3746802)與食管癌的遺傳易感性，旨在揭示遺傳與環(huán)境的相互作用關(guān)系，建立食管癌高危人群篩查的生物指標(biāo)，為食管癌的個(gè)體化防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　 2、材料及方法
　　 2.1、血清核黃素水平測(cè)定
　　 2.1.1、研究對(duì)象和血樣采集
　　 研究對(duì)象分為三組:①對(duì)照組:選擇2008年6月-2010年9月于長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)

8、院附屬和平醫(yī)院行胃鏡檢查并證實(shí)無(wú)食管、賁門(mén)和胃粘膜癌變的健康人群，共689例，其中男性530例（平均年齡:56.9±7.3歲），女性159例（平均年齡:58.1±5.8歲）:②食管癌組:經(jīng)病理為食管鱗癌的患者，共445例，其中男性362例（平均年齡:57.3±5.9歲），女性83例（平均年齡:56.9±8.7歲），（所有患者均非林州移民或其后裔）;③林移組:居住于長(zhǎng)治縣林移村的河南省林州市健康移民人群，共347例，其中男性270例（平均

9、年齡:55.6±9.3歲），女性77例（平均年齡:54.1±8.9歲）。
　　 血樣采集:上述人群均采集5ml空腹靜脈血樣，并于-40℃冰箱保存。
　　 2.1.2、研究方法
　　 提取人群血樣DNA，采用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測(cè)對(duì)照組、食管癌組和健康林移組人群血漿中核黃素水平。ELISA試劑盒（人維生素B2酶聯(lián)免疫分析試劑盒）購(gòu)自R&D公司。
　　 2.2、組織核黃素水平測(cè)定
　　 2.2.1、研究

10、對(duì)象和組織收集
　　 研究對(duì)象分為兩組:①對(duì)照組:選擇2010年9月-2011年2月于長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院行胃鏡檢查并證實(shí)無(wú)食管、賁門(mén)及胃粘膜病變的健康人群，共289例，其中男性177例（平均年齡:57.1±6.8歲），女性112例（平均年齡:58.1±7.9歲）;②食管癌組:選擇2009年8月-2011年4月于長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院住院并經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗癌的患者，共250例，其中男性142例（平均年齡:58.3±5.2歲）

11、，女性108例（平均年齡:57.3±6.4歲）。
　　 組織采集:為食管癌手術(shù)切除標(biāo)本。①食管癌組:為肉眼觀察壞死組織較少、黏膜尚完整的癌塊組織;②對(duì)照組:癌組織5cm外、經(jīng)病理切片證實(shí)無(wú)癌變的食管黏膜組織。所有標(biāo)本以銳刀切取，包括食管全層:黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層，于-80℃冰箱保存。
　　 2.2.2、研究方法
　　 將組織標(biāo)本從-80℃冰箱中取出，電子天平上稱(chēng)取各標(biāo)本100mg（包括對(duì)照組和食管癌組）

12、，加10mMPBS溶液1mL，組織勻漿儀充分勻漿后，將勻漿倒入離心管中離心20min，2000r/min，取上清200μL備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按照HumanVB2ELISAKit試劑盒操作步驟檢測(cè)各組組織中核黃素水平。
　　 2.3、C20orf54基因中三個(gè)SNP位點(diǎn)與食管癌遺傳易感性
　　 2.3.1、研究對(duì)象及血樣采集
　　 研究對(duì)象分為兩組:①對(duì)照組:選擇2008年6月-2010年9月

13、于長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院行胃鏡檢查并證實(shí)無(wú)食管、賁門(mén)及胃粘膜癌變的健康人群，共198例，其中男性130例（平均年齡:57.4±5.3歲），女性68例（平均年齡:56.9±6.1歲）;②食管組:經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗癌的患者，共240例，其中男性159例（平均年齡:57.9±7.6歲），女性81例（平均年齡:58.5±9.1歲）。病例資料內(nèi)容詳細(xì)包括性別、年齡、吸煙史、血型、體質(zhì)指數(shù)、抽煙飲酒史和家族史。
　　 血樣采集:上述人群均采

14、集5ml空腹靜脈血樣，-40℃冰箱保存。
　　 2.3.2、研究方法
　　 從分子水平上探討“C20orf54基因型→核黃素水平（血漿及組織）→食管黏膜病變（正常黏膜、癌前病變）→食管癌發(fā)生”的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與食管癌變相關(guān)的錯(cuò)義cSNP位點(diǎn)。
　　 C20orf54基因共有9個(gè)錯(cuò)義cSNP位點(diǎn)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?geneId=11

15、3278)，我們對(duì)其中7個(gè)SNP位點(diǎn)的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:食管癌患者中有3個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)存在SNP錯(cuò)義(mRNApos1139、1172、1246)，以1139和1172位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率最高。
　　 采用Promega公司的Maxwell(R)16System及試劑盒提取全血中基因組DNA。以提取出來(lái)的全基因組DNA為模板，擴(kuò)增C20orf54基因的3號(hào)外顯子(含有三個(gè)cSNP位點(diǎn)-mRNAPOS，1139，1172，1246)，由上海

16、生工生物有限公司合成引物如下:
　　 上游5'GGAGTTCCCAGAGCTTTGGTGTCCG3'
　　 下游5'CATAGGACAGGCAGGAGTAGGT3'
　　 PCR擴(kuò)增3號(hào)外顯子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京華大基因完成測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，找出三個(gè)cSNP位點(diǎn)，計(jì)算突變頻率。
　　 2.4、統(tǒng)計(jì)分析
　　 使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，三組間差

17、異比較采用方差分析，三組間兩兩比較采用Bonfferoni法。應(yīng)用免費(fèi)在線軟件檢查各個(gè)人群基因型分布是否符合哈迪溫伯格平衡(http://www.kursus.kvl.dk/shares/vetgen/_Popgen/genetik/applets/kitest.htm)，應(yīng)用Logistic回歸檢驗(yàn)各基因型以及不同組合對(duì)食管癌的患病風(fēng)險(xiǎn)的影響（OR值以及其95％可信區(qū)間）。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、結(jié)果

18、r>　　 3.1、血清核黃素水平測(cè)定
　　 3.1.1、三組年齡、性別構(gòu)成比較
　　 食管癌組病例445例，男、女所占比例分別為81.35％和18.65％;≥50歲和＜50歲的男性患者所占比例分別為57.75％和23.60％，≥50歲和＜50歲的女性患者所占比例分別為10.56％和8.09％。對(duì)照組人群689例，男女構(gòu)成比分別為76.92％和23.08％;≥50歲和＜50歲的男性患者所占比例分別為49.20％和27.7

19、2％，≥50歲和＜50歲的女性患者所占比例分別為16.40％和6.68％。林州移民組347例，男、女構(gòu)成比分別為77.81％和22.19％;≥50歲和＜50歲的男性患者所占比例分別為51.30％和26.51％，≥50歲和＜50歲的女性患者所占比例分別為9.51％和12.68％。三組人群在年齡、性別構(gòu)成上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.1.2、三組核黃素水平比較
　　 食管癌組血清中核黃素水平顯著低于對(duì)照組(73

20、1.69±330.67ug/Lvs1090.43±445.08ug/L，P＜0.05)和林移組（731.69±330.67ug/Lvs897.58±177.78ug/L，P＜0.05）;而對(duì)照組血漿中核黃素水平(1090.43±445.08ug/L)高于林移組(897.58±177.78ug/L)(P＜0.05)。
　　 3.2、組織核黃素水平測(cè)定
　　 3.2.1、兩組年齡、性別構(gòu)成
　　 食管癌組:共250例

21、，男、女構(gòu)成比例分別為56.8％和43.2％;≥50歲和＜50歲患者比例分別為76.4％和23.6％;男性患者中，≥50歲和＜50歲的患者比例分別為42.4％和14.4％;女性患者中，≥50歲和＜50歲的患者比例分別為34.0％和9.2％。
　　 對(duì)照組:共289例，男、女構(gòu)成比分別為61.2％和38.8％;≥50歲和＜50歲的健康體檢者所占比例分別為69.6％和30.4％;在男性人群中，≥50歲和＜50歲人群所占比例分別為43

22、.6％和17.6％;在女性人群中，≥50歲和＜50歲人群所占比例分別為26.0％和12.8％。
　　 3.2.2、兩組核黃素水平比較
　　 食管癌組患者血漿中核黃素水平顯著低于對(duì)照組人群(753.46±624.56vs1097.63±808.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);食管癌組織中核黃素含量低于邊緣正常對(duì)照組織含量(17.45±3.43vs22.06±3.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

23、　　 3.3、C20orf54基因中三個(gè)cSNP位點(diǎn)與食管癌遺傳易感性的研究
　　 3.3.1、兩組性別、年齡、吸煙人數(shù)、飲酒、家族史、血型及BMI構(gòu)成
　　 食管癌組和對(duì)照組在性別、年齡與吸煙人數(shù)構(gòu)成等方面無(wú)差異。飲酒者和有UGIC家族史者在ESCC中的比例（分別為:46.7％和27.5％）明顯高于對(duì)照組（分別為:37.2％和18.2％），因此飲酒和UGIC家族史可顯著增加人群ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.045和P=

24、0.014)，經(jīng)性別、年齡狀況校正后的OR值分別為1.78(95％CI=1.12-2.83)和1.75(95％CI=1.10-2.79);不同血型的人群在食管癌組與對(duì)照組分布不同(P=0.021)，B血型人群ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于A型血型人群，經(jīng)性別、年齡狀況校正后的OR值為0.52(95％CI=0.31-0.87);不同BMI指數(shù)的人群在食管癌組與對(duì)照組分布亦不同(P=0.000)，相對(duì)于BMI＞24的人群，BMI＜18.5和BM

25、I為18.5-24之間的人群顯著增加A型血型人群ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)性別、年齡狀況校正后的OR值分別為4.52(95％CI=2.34-8.72)和2.70(95％CI=1.67-4.37)。
　　 3.3.2、C20orf54基因rs3746804、rs3746803、rs3746802位點(diǎn)多態(tài)性分析
　　 3.3.2.1、C20orf54基因rs3746804(1139C＞T)位點(diǎn)多態(tài)性分析
　　 C20or

26、f54基因rs3746804位點(diǎn)基因型的頻率在食管癌組和對(duì)照組中分布符合Handy-Weinberg平衡(x2=2.58，P=0.108)。在食管癌患者和對(duì)照組中C/C、C/T和T/T各基因型的頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(x2=8.06，P=0.018)。在調(diào)整了年齡、性別等因素后，攜帶C/T基因型的個(gè)體較C/C攜帶者罹患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低(校正OR=0.58，95％CI:0.38-0.88)。
　　 對(duì)吸煙、飲酒、家族史、血型

27、和體質(zhì)指數(shù)等因素分層后進(jìn)行條件logistic回歸分析，結(jié)果顯示，ESCC組和對(duì)照組中吸煙者的基因型頻率分布有顯著差異。與C/C相比，C/T基因型不但可以顯著降低吸煙組ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.37，95％CI:0.20-0.68），而且顯著降低飲酒組ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.31，95％CI:0.15-0.64）。同時(shí)，ESCC組和對(duì)照組中無(wú)UGIC家族史的人群基因型頻率分布亦有顯著性差

28、異（經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.48，95％CI:0.30-0.78）。在BMI為18.5-24的組中，ESCC患者組和對(duì)照組基因型頻率分布有顯著性差異。與C/C相比，C/T基因型也可顯著降低吸煙組ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.56，95％CI:0.32-0.96)。
　　 3.3.2.2、C20orf54基因rs3746803(1172C＞T)位點(diǎn)多態(tài)性分析
　　 食管癌組和對(duì)照組中C/C、C/T

29、和T/T基因型的頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=13.10，P=0.001)。在調(diào)整了年齡、性別等因素后，攜帶C/T基因型和T/T基因型的個(gè)體較C/C攜帶者罹患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（校正OR=0.66，95％CI:0.41-1.05）。
　　 對(duì)吸煙、飲酒、家族史、血型和體質(zhì)指數(shù)等因素分層后進(jìn)行條件logistic回歸分析，結(jié)果顯示在不吸煙組中，與C/C相比，C/T和T/T基因型顯著降低食管癌發(fā)生率（經(jīng)年齡和性別校正后OR=0

30、.47，95％CI:0.23-0.97），在無(wú)UGIC家族史的人群中，C/T和T/T基因型亦顯著降低食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(經(jīng)年齡和性別校正后的OR=0.57，95％CI:0.34-0.98)。然而，在有UGIC家族史的人群中，與C/C相比，C/T和T/T基因型增加食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在O型血人群中，C/T和T/T基因型亦顯著增加食管癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性(經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.30和0.47，95％CI:0.22-0.99)。<

31、br>　　 3.3.2.3、C20orf54基因rs3746802(1246A＞G)位點(diǎn)多態(tài)性分析
　　 食管癌組和對(duì)照組中C/C、C/T和T/T各基因型的頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（x2=7.97，P=0.019）。在調(diào)整了年齡、性別等因素后，攜帶A/G基因型和G/G基因型的個(gè)體較A/A攜帶者罹患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（校正OR=0.53，95％CI:0.34-0.84）。
　　 對(duì)吸煙、飲酒、家族史、血型和體質(zhì)指數(shù)等因

32、素分層后進(jìn)行條件logistic回歸分析，結(jié)果顯在不吸煙組中，與A/A相比，A/G和G/G基因型顯著降級(jí)食管癌發(fā)生率（經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.46，95％CI:0.23-0.92）。在喝酒人群中，與A/A相比，A/G和G/G基因型顯著降級(jí)食管癌發(fā)生率(經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.39，95％CI:0.19-0.82)。在無(wú)UGIC家族史的人群中，與A/A相比，A/G和G/G基因型顯著降級(jí)食管癌發(fā)生率(經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.55

33、，95％CI:0.33-0.92)。
　　 4、結(jié)論
　　 4.1、對(duì)照組血清核黃素水平高于林州組，而林州組高于食管組。表明，食管癌患者血漿中存在核黃素缺乏現(xiàn)象。
　　 4.2、食管癌組織中核黃素水平顯著低于對(duì)照組組織中核黃素水平(17.45±3.43vs22.06±3.21，P＜0.001)，提示核黃素缺乏與食管癌發(fā)生相關(guān)。
　　 4.3、C20orf54基因中三個(gè)錯(cuò)義SNP位點(diǎn)rs3746804、rs