顱內動脈瘤患者血清雙向膠內差異凝膠電泳技術建立及患者血清蛋白組的變化和意義.pdf

1、研究背景 顱內動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)是腦動脈系統(tǒng)有破裂傾向的局限性病理擴張，動脈瘤破裂引起的蛛網膜下腔出血占全部自發(fā)性蛛網膜下腔出血的70％-80％，是神經外科的危重急癥之一，患者死亡率、致殘率極高，嚴重威脅著患者的生命健康，同時給家庭和社會也帶來了沉重負擔。如果在IA破裂前，能及時明確診斷并給予神經介入栓塞或顯微外科手術等恰當的治療，患者預后可以大大改善。但是由于IA的具體病因、發(fā)病機制

2、不清，尚未有有效的生化指標可以預測IA的存在，因此目前IA的診斷和篩選主要依靠腦血管造影(DSA)、磁共振血管造影(MRA)和CT血管造影(CTA)。三種診斷方法均費用高昂，難以進行大規(guī)模篩查，同時，作為金標準的DSA是有創(chuàng)檢查，更難于被檢查對象所接受。對IA患者血清進行蛋白組學研究，尋找患者血清中差異表達的蛋白質，并與以往對IA的基因研究資料相結合，不僅有助于從分子水平認識IA的發(fā)生發(fā)展機制，也可以為IA的篩選和診斷提供有效的分子標記

3、物，并有望為IA的防治提供新的分子靶點。 應用蛋白組學方法，已經發(fā)現了許多蛋白的表達差異與特定中樞神經系統(tǒng)疾病相關，例如克一雅氏病可能與載脂蛋白E的表達差異有關，β-2微球蛋白、視黃醇結合蛋白、甲狀腺素轉運蛋白可能與老年癡呆有關。但是，傳統(tǒng)的雙向電泳技術靈敏度較低，難以檢測低豐度蛋白質，同時由于每塊膠只能分離一個樣本，因而受人為操作的影響，膠間的差異較大，實驗室間可重復性也較差。 雙向膠內差異凝膠電泳(Two-dimen

4、tional difference in-gel electrophoresis，Z-DDIGE)是近年來發(fā)展起來了一項新型電泳技術，該技術使用了一組特殊的CyDyeDIGE熒光染料(Cy2、Cy3、Cy5)，對低豐度蛋白的探測靈敏度大幅度提高，同時由于內標的建立，大大減少了人為因素影響，可信度大幅提高。因而，該技術正受到越來越多蛋白組學研究者的歡迎。顱內動脈瘤患者血清2-D DIGE技術尚未建立，應用該技術尋找顱內動脈瘤患者血清中表達

5、差異蛋白質的研究，目前國內外均未見報道。 研究目的 1．建立顱內動脈瘤患者血清雙向膠內差異凝膠電泳技術體系，為下一步利用該技術研究顱內動脈瘤患者血清蛋白組變化奠定基礎。 2．尋找顱內動脈瘤患者血清中表達差異的蛋白質，探討這些蛋白在顱內動脈瘤 發(fā)生發(fā)展中的作用，為顱內動脈瘤的早期診斷和篩選提供潛在的分子標記物。 3．應用Western blot技術驗證質譜鑒定結果的真實性、可靠性。 研究方法

6、 1．收集顱內動脈瘤、腦挫裂傷患者和正常成人血清樣本各4例，血清經PROT-BA Kit試劑盒處理后，分別進行不同的CyDye染料交叉標記，然后依次進行雙 向膠內差異凝膠電泳、圖像掃描并用專用分析軟件DeCyder v6.0比較各組樣本間蛋白點圖像差異，并評估該技術體系。 2．提取顱內動脈瘤患者、腦挫裂傷患者及正常成人血清蛋白，用不同的CyDye 染料交叉標記后依次進行雙向膠內差異凝膠電泳以分離蛋白質、圖像分析以 尋找

7、表達差異的蛋白點，對表達差異的蛋白點進行基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜分析，獲得肽指紋圖譜，檢索MASCOT數據庫鑒定蛋白。 3．收集顱內動脈瘤20例、腦挫裂傷伴蛛網膜下腔出血患者22例和正常成人血清樣本21例，提取血清總蛋白，行SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉印至醋酸 纖維素膜，與小鼠抗人結合珠蛋白多克隆抗體、山羊抗人間-α-胰蛋白酶抑制 因子重鏈相關蛋白多克隆抗體、兔抗人α1-抗糜蛋白酶單克隆抗體以及兔抗 人載脂蛋

8、白J多克隆抗體一抗、相應二抗共孵，放入超敏發(fā)光液充分浸泡后,置入凝膠成像系統(tǒng)曝光、圖像掃描，GnenTool軟件測得蛋白條帶吸光度值,行各組間匕述蛋白表達量的比較。 研究結果 1．經過雙向差異電泳，在所有pH3-10的梯度膠條上均得到了蛋白質表達譜，經軟件處理，不同染料標記的樣本呈現不同顏色的圖譜，在每塊膠上均可發(fā)現 數以千計的蛋白質點。使用：DeCyder軟件分析發(fā)現，腦動脈瘤患者與正常成人血清中差異點21個，腦挫裂

9、傷患者與正常成人血清中差異點19個，腦動 脈瘤患者與腦挫裂傷患者差異點10個，各組間差異點有部分交叉，共有38 個點差異表達1.5倍以上。 2．經圖像分析發(fā)現，有11個蛋白點僅在顱內動脈瘤患者與正常成人間存在有統(tǒng) 計學意義的表達差異，經質譜鑒定，其中的7個蛋白點得以確認為5種已知 蛋白質，分別為：結合珠蛋白、α1-抗糜蛋白酶、富含亮氨酸α2糖蛋白、載脂蛋白J(凝聚素)及間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈相關蛋白。這些蛋白在顱

10、內動脈瘤患者血清中均表達升高1.5倍以上。 3．經凝膠分析儀處理，各實驗組均可觀察到相應特異性蛋白條帶。證明質譜鑒定結果無誤。圖像及吸光度統(tǒng)計分析均顯示，上述蛋白在顱內動脈瘤患者血 清中表達量升高，在腦挫裂傷患者血清中沒有表達差異。 結論 1．成功建立了顱內動脈瘤患者血清雙向膠內差異電泳技術體系，為研究顱內動脈瘤發(fā)生發(fā)展分子機制提供了一種有效手段。 2．結合珠蛋白、α1-抗糜蛋白酶、富含亮氨酸α2 糖蛋