math5調(diào)控視網(wǎng)膜m252;ller細(xì)胞向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞定向分化的研究

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文Math5調(diào)控視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞定向分化的研究姓名：曾琦申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：夏曉波20100501博士學(xué)位論文 中文摘要第二章P E G F P - N 1 ．M a t h 5 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及視網(wǎng)膜干細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的 構(gòu)建P E G F P - N 1 ．M a t h 5 真核表達(dá)質(zhì)粒。探討以M t i l l e r 細(xì)胞去分化而來(lái)的視網(wǎng)膜干細(xì)胞作為基因靶細(xì)胞，電

2、穿孔法轉(zhuǎn)染M a t h 5基因的可行性。方法 構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒P E G F P ．N 1 ．M a t h 5 。采用酶切及基因測(cè)序鑒定。然后選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染的方法，分別將m a t h 5基因轉(zhuǎn)染M t i l l e r 細(xì)胞去分化而來(lái)的干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果連接產(chǎn)物經(jīng)E c o R I 及B a m H I 雙酶切鑒定，產(chǎn)生約4 ．7 k b和4 5 0 b p 的兩個(gè)D N A 片段，與

3、連接前載體和插入片段大小相符，證實(shí)成功獲得了P E G F P ．N 1 ．M a t h 5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒P E G F P ．N 1 ．M a t h 5 的正、反向序列測(cè)定分析顯示，M a t h 5 的序列與G e n eB a n k 中M a t h 5e D N A 的序列完全一致。陽(yáng)離子脂質(zhì)體L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 和電穿孔法介導(dǎo)M a t h 5 基因轉(zhuǎn)染M f

4、i l l e r 細(xì)胞去分化而來(lái)的干細(xì)胞，4 8 h 時(shí)轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到最高，分別為O ．1 3 + 0 ．1 7 ％和1 5 ．5 4 + 2 ．4 3 ％。電穿孔法較脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)M a t h 5 基因有更好的表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < O ．0 1 ) 。結(jié)論 電穿孔法可使視網(wǎng)膜M f i l l e r 細(xì)胞去分化而來(lái)的干細(xì)胞得到較高效的基因表達(dá)。這將為視神經(jīng)再生的基因治療和進(jìn)一步的干細(xì)胞研究奠定基礎(chǔ)