成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞的研究.pdf

1、再生醫(yī)學(xué)的首要目的是生成可以替代受損組織的細(xì)胞，在這方面有諸多非常具有創(chuàng)新性的研究。2006年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的成功生成是細(xì)胞生物學(xué)以及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里程碑式的進(jìn)步，為再生醫(yī)學(xué)研究清除了多年來(lái)面臨的倫理障礙。最近的研究在此基礎(chǔ)上，成功實(shí)現(xiàn)了一個(gè)更加大膽的理念，即一種分化成熟的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為另外一種分化成熟的細(xì)胞。比如易于取材的皮膚成纖維細(xì)胞，已經(jīng)成功轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞，肝臟細(xì)胞，神經(jīng)元等。這些轉(zhuǎn)分化所得的細(xì)胞可以回植入機(jī)體，實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化細(xì)

2、胞替代療法，避免排斥反應(yīng)。本研究擬采用非基因組整合性的腺病毒，實(shí)現(xiàn)皮膚成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。
　　第一部分利用腺病毒將小鼠成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元
　　目的:利用腺病毒作為載體，過(guò)表達(dá)神經(jīng)元相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和成年成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為具有功能的神經(jīng)元。
　　方法:神經(jīng)元相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Asc11，Brn2，Myt11和Ngn2分別被構(gòu)建入pAd/CMV/V5-DEST7.3腺

3、病毒載體中，通過(guò)轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞系，包裝出高滴度的帶有外源基因的腺病毒。C57BL/6J小鼠胚胎期E13.5天的胚胎背部成纖維細(xì)胞及成年6～8周C57BL/6J小鼠的耳尖成纖維細(xì)胞分別被不同組合的腺病毒Asc11+Brn2+Myt11(ABM)或Asc11+Brn2+Ngn2(ABN)感染。感染后13天到30天期間，利用免疫組織化學(xué)方法觀察神經(jīng)元的產(chǎn)生，以及不同神經(jīng)元標(biāo)記物的表達(dá)，并通過(guò)電流鉗和電壓鉗方法檢測(cè)轉(zhuǎn)分化得到的神經(jīng)元的電生理特

4、性。最后，利用PCR及核酸雜交方法，檢測(cè)腺病毒所攜帶的外源基因和載體片段在被感染細(xì)胞基因組內(nèi)的整合情況。
　　結(jié)果:兩種腺病毒組合ABM和ABN都能將胚胎成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。在感染后13天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Tuj1免疫組織化學(xué)染色，在ABN組有2.94％±0.73％的胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元，在ABM組有1.64％±0.59％的胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元，ABN和ABM組產(chǎn)生的神經(jīng)元都可以發(fā)放動(dòng)作電位。ABN組產(chǎn)生的神經(jīng)元

5、可以表達(dá)多種神經(jīng)元特有的標(biāo)記物，如Map2a，NeuN和Synapsin;通過(guò)更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)（20-25天），還可以檢測(cè)到興奮性神經(jīng)元標(biāo)記物vGLUT和抑制性神經(jīng)元標(biāo)記物GAD67的表達(dá)。通過(guò)與大鼠皮層神經(jīng)元的共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)分化產(chǎn)生的神經(jīng)元還可以檢測(cè)到興奮性突觸后電流。利用ABN組合感染小鼠成年成纖維細(xì)胞，兩周后同樣檢測(cè)到了Tuj1陽(yáng)性的神經(jīng)元，并且轉(zhuǎn)分化所得的神經(jīng)元同樣具有原代培養(yǎng)神經(jīng)元特有的電生理特性。PCR和核酸雜交結(jié)果顯示，感染后的

6、胚胎成纖維細(xì)胞的基因組中未發(fā)現(xiàn)外源基因及腺病毒載體片段的整合。
　　結(jié)論:利用腺病毒作為載體，過(guò)表達(dá)Asc11, Brn2及Ngn2，可以成功地將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和成年成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為有功能的神經(jīng)元，并且所得細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)外源基因及腺病毒載體片段的整合。腺病毒介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)分化過(guò)程更加安全，具有更加廣闊的臨床應(yīng)用前景。
　　第二部分:利用腺病毒將小鼠成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞
　　目的:利用腺病毒作為載

7、體，過(guò)表達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和成年成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為具有功能的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞。
　　方法:視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因Asc11，Brn2，Ngn2，Ath5，Brn3b，Nf1和Pax6分別被構(gòu)建入pAd/CMV/V5-DEST7.3腺病毒載體中，通過(guò)轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞系，包裝出高滴度的帶有外源基因的腺病毒。通過(guò)7種基因的不同分組感染C57BL/6J小鼠胚胎期E13.5天的背部成纖維細(xì)胞，利

8、用Tuj1和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)記物的雙重染色，篩選出最有效的轉(zhuǎn)錄因子組合。對(duì)轉(zhuǎn)分化得到的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞進(jìn)行多重標(biāo)記物染色，并利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)這些細(xì)胞的電生理特性。利用相同的轉(zhuǎn)錄因子組合感染小鼠成年成纖維細(xì)胞，檢測(cè)多種視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)情況，以及轉(zhuǎn)分化所得視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞的電生理特性。最后，利用PCR方法，檢測(cè)腺病毒所攜帶的外源基因在被感染細(xì)胞基因組內(nèi)的整合情況。
　　結(jié)果:經(jīng)過(guò)篩選，Asc1+Brn3

9、b+Ngn2組合可以將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)分化所得的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)多種視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，并且具有成熟神經(jīng)元的電生理特性。不同的標(biāo)記物標(biāo)記的轉(zhuǎn)發(fā)化效率大致一致，在3.58％-4.00％之間。Asc1+Brn3b+Ngn2組合還可以將小鼠成年成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞，同樣具有成熟神經(jīng)元的電生理特性。通過(guò)PCR的檢測(cè)驗(yàn)證轉(zhuǎn)分化過(guò)程未發(fā)生外源基因在宿主基因組中的整合。