全反式維甲酸對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長及Cx43基因表達(dá)的影響.pdf

1、第一章 Cx43分子在人正常視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)組織中的表達(dá)。 目的：探討細(xì)胞間隙連接蛋白(Cx)43在人類正常視網(wǎng)膜組織及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)組織中的表達(dá)規(guī)律及其在RB腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的意義，為RB臨床診斷、治療及預(yù)后探索有效的分子指標(biāo)。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)5例人正常視網(wǎng)膜組織和22例人RB組織中Cx43蛋白的表達(dá)及定位，并分別比較正常視網(wǎng)膜組織、RB組織及其瘤旁組織、未分化型與分化型RB組織

2、、局限期及蔓延擴(kuò)展期腫瘤組織中Cx43蛋白表達(dá)的差異。 結(jié)果： 1．在人類視網(wǎng)膜組織神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、視錐視桿細(xì)胞層、外界膜及色素上皮層中均有Cx43蛋白表達(dá)：在神經(jīng)纖維層、視錐視桿細(xì)胞層、外界膜及色素上皮層中呈全層性表達(dá)，而在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層則呈散在點(diǎn)、簇狀表達(dá)。內(nèi)界膜、內(nèi)、外叢狀層及外核層未見明顯表達(dá)。 2．免疫組織化學(xué)染色評(píng)分：①RB組織中Cx43蛋白染色評(píng)分低于正常視網(wǎng)膜組織，二者相比

3、差異有顯著性意義(P<0.01)；②蔓延擴(kuò)展期(Ⅳ～Ⅴ級(jí))組織染色評(píng)分顯著低于局限期(Ⅰ～Ⅲ級(jí))組織(P<0.05)，而每期內(nèi)各級(jí)組間相比均無顯著性差異(P>0.05)；③分化型RB組織中，Cx43蛋白染色評(píng)分高于未分化型組織，二者相比有顯著性差異(P<0.05)；④在正常視網(wǎng)膜組織、瘤旁組織及RB腫瘤組織中染色評(píng)分依次降低，兩兩相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1．人正常視網(wǎng)膜組織中存在Cx43蛋白的

4、固有、廣泛表達(dá)。 2．人RB組織中Cx43蛋白表達(dá)顯著降低，其表達(dá)水平與腫瘤的蔓延浸潤及分化程度呈負(fù)相關(guān)，而與腫瘤的體積大小無關(guān)。 3．Cx413蛋白表達(dá)異?？赡苁荝B腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)和促發(fā)因素，檢測(cè)其表達(dá)可能將作為評(píng)估腫瘤預(yù)后的有意義指標(biāo)。 第二章全反式維甲酸對(duì)體外培養(yǎng)的RB細(xì)胞生長的影響。 目的：研究全反式維甲酸(ATRA)對(duì)體外培養(yǎng)的RB細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探索RB腫瘤藥物治療的新方法。

5、 方法：將體外培養(yǎng)的RB細(xì)胞隨機(jī)分為5組：A組：空白對(duì)照組；B組：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(0.1％乙醇溶劑組)；C組：10<'-5> mol/L ATRA作用組；D組：10<'-6> mol/L ATRA作用組；E組：10<'-7> mol//L ATRA作用組。加入藥物進(jìn)行干預(yù)后，分別于48h、96h和144h收集各組細(xì)胞。應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況。 結(jié)果： 1．AT

6、RA誘導(dǎo)RB細(xì)胞增殖減少：與對(duì)照組A、B相比，經(jīng)ATRA作用后，各實(shí)驗(yàn)組(C、D、E組)RB細(xì)胞均表現(xiàn)生長速度下降，存活率降低，其存活率變化與藥物濃度和作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 2．ATRA誘導(dǎo)RB細(xì)胞生長周期和凋亡發(fā)生改變：與對(duì)照組相比，三實(shí)驗(yàn)組G<,0>/G<,1>期細(xì)胞比例逐漸增加而G<,2>M、S期細(xì)胞比例相應(yīng)減少，同時(shí)，細(xì)胞凋亡率也逐漸升高。G<,0>/G<,1>期比例和凋亡率的增加與藥物濃度和作用時(shí)間呈正向變化關(guān)系。

7、 結(jié)論： 1．ATRA可抑制體外培養(yǎng)RB細(xì)胞的生長增殖。 2．ATRA通過阻滯RB細(xì)胞生長周期于G<,0>/G<,1>期并促進(jìn)其凋亡而抑制細(xì)胞生長。在一定范圍內(nèi)，增加藥物濃度或延長作用時(shí)間可增強(qiáng)此藥物效應(yīng)。 第三章全反式維甲酸對(duì)RB細(xì)胞Cx43基因及其蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用。 目的：研究ATRA對(duì)體外培養(yǎng)的RB細(xì)胞Cx413基因及其蛋白表達(dá)的影響，探討ATRA抑制RB細(xì)胞生長的作用機(jī)制。 方法：

8、同前進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組和藥物干預(yù)，分別于藥物作用后48h、96h和144h收集各組細(xì)胞。應(yīng)用Western blot印跡法檢測(cè)Cx43蛋白的表達(dá)變化；RT-PCR方法檢測(cè)Cx43mRNA的表達(dá)及改變。 結(jié)果： 1．經(jīng)ATRA作用后RB細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)增高：與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組Cx413蛋白電泳條帶的光密度比率(ODR)值均增加。藥物作用48h后C組、作用96h后D組以及作用144h后E組其ODR值與A組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯

9、著性差異(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ODR值的變化與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。 2．經(jīng)ATRA作用后RB細(xì)胞的Cx43 mRNA表達(dá)增加：與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組Cx43 mRNA電泳條帶ODR值均逐漸升高。ATRA作用48h后C組以及作用96h后D、E兩組ODR值與A組相比增高在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ODR值的增加與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。 3．ATRA誘導(dǎo)R

10、B細(xì)胞中Cx43mRNA及其蛋白表達(dá)增高與其抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在時(shí)間上具有同步性。 結(jié)論： 1．通過誘導(dǎo)RB細(xì)胞Cx43基因表達(dá)上調(diào)從而抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡是ATRA的重要藥理機(jī)制之一，在一定范圍內(nèi)，增加藥物濃度或延長藥物作用時(shí)間可增強(qiáng)此效應(yīng)。 2．ATRA調(diào)控Cx43基因表達(dá)的作用位點(diǎn)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。 3．Cx43基因及其蛋白分子是RB腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。 第四章裸鼠眼內(nèi)RB模型

11、的建立及全反式維甲酸對(duì)在體腫瘤的抑制作用。 目的：通過動(dòng)物模型檢驗(yàn)ATRA對(duì)裸鼠RB腫瘤生長的影響，為藥物的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：裸鼠眼前房接種體外培養(yǎng)的HXO-RB44細(xì)胞建立動(dòng)物RB模型。將成瘤裸鼠隨機(jī)分為3組：A：空白對(duì)照組，即非治療組；B：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，即假治療組(用0.5％無水乙醇的生理鹽水行前房注射)；C：治療組，用1μg ATRA行眼前房注射。給藥頻率：每3d注射一次，共治療3周。每天觀察動(dòng)物眼

12、前房腫瘤形成情況及眼前節(jié)局部反應(yīng)。觀察結(jié)束時(shí)，摘取眼球制作石蠟切片，應(yīng)用HE染色方法檢測(cè)眼內(nèi)腫瘤的生長情況及病理學(xué)特征。 結(jié)果: 1．前房接種體外培養(yǎng)的HXO-RB414細(xì)胞成功建立了BALB/C裸鼠眼部RB腫瘤動(dòng)物模型，成瘤率為73.3％。 2．動(dòng)物于接種后6～9d開始成瘤。A組腫瘤生長快，于接種20d后幾乎占據(jù)整個(gè)前房；觀察期末(接種后25～30d)，術(shù)眼眼球脹大，角膜水腫并新生血管形成。C組腫瘤生長較A組緩

13、慢，接種后20d該組最大腫瘤體積約占前房1/3；觀察期末，最大腫瘤體積<3/4前房。該組腫瘤控制率為50％。B組腫瘤體積變化與A組相比無明顯差別，腫瘤控制率0％。 3．組織切片病理學(xué)檢查：A、B組瘤體細(xì)胞生長較緊密，前房、晶體后及玻璃體腔均可見瘤細(xì)胞生長；C組腫瘤組織相對(duì)疏松，瘤細(xì)胞分布基本局限于前房，少量見于虹膜后方，但晶體后及玻璃體腔未見瘤細(xì)胞侵犯。移植瘤組織學(xué)特點(diǎn)與人RB腫瘤組織相似，細(xì)胞形態(tài)光鏡下觀察三組間未見明顯差別。