全反式維甲酸誘導神經(jīng)母細胞瘤分化及TrkA剪接異構(gòu)體表達的研究.pdf

1、目的:
　　 神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童常見的交感神經(jīng)系統(tǒng)的惡性胚胎源性腫瘤。其臨床表現(xiàn)及基因表型均具有高度異質(zhì)性。酪氨酸激酶受體A(TrkA)在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟中占有重要的地位,對NB細胞生長、分化及凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用。既往認為TrkA是NB預后良好的標志,但在作者所在研究組對TrkA進行研究時發(fā)現(xiàn),一些高表達TrkA的NB卻具有更具侵襲性的腫瘤行為并易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。最近文獻報道了NB中存在與

2、已知的兩種TrkA剪接異構(gòu)體TrkAⅠ及TrkAⅡ功能相反的剪接異構(gòu)體TrkAⅢ,TrkAⅢ可促進NB侵襲性生長,增加NB細胞耐藥性。這就為某些NB高表達TrkA卻具有更強侵襲性的原因提供了解釋。全反式維甲酸(all-trans-retinonic acid,ATRA)能夠在體外誘導NB細胞分化,并抑制細胞增殖,可用于建立SH-SY5Y細胞的分化模型。目前國內(nèi)外對TrkAⅢ的研究均未廣泛開展,對TrkAⅢ的產(chǎn)生及作用機制尚未明確。

3、>　　 本實驗通過對NB細胞系SH-SY5Y進行體外實驗,研究ATRA對NB細胞的增殖抑制與誘導分化作用,進而探討TrkA剪接異構(gòu)體在不同分化程度的SH-SY5Y細胞中的表達情況。這在國內(nèi)外文獻未見報道,本研究將為進一步研究TrkAⅢ剪接亞型的產(chǎn)生及作用機制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 一、細胞培養(yǎng),形態(tài)學觀察及細胞計數(shù)
　　 將SH-SY5Y細胞進行復蘇培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞,培養(yǎng)24h后分為實驗組

4、及對照組,實驗組用0.1、1.0及10.0μmol/L ATRA處理,對照組不加任何藥物,分別于細胞培養(yǎng)的第1,3,5和7d利用臺盼藍拒染計數(shù)活細胞,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。
　　 二、實時定量熒光PCR
　　 分別收集用0.1、1.0、10μmol/L的ATRA處理1、3、5、7d的SH-SY5Y細胞,提取總RNA,按試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應體系合成cDNA;引物由Takara公司設(shè)計合成,采用SYBRGr

5、eenⅠ實時定量熒光PCR方法,以GAPDH為內(nèi)參照,進行SYRB GreenⅠ實時熒光定量PCR,檢測TrkA三種剪接異構(gòu)體的表達水平。
　　 三、結(jié)果判斷
　　 將標準品cDNA8倍濃度梯度稀釋為5-6個濃度梯度,各取2μL作為模板進行RealTime PCR反應,由各擴增曲線得到的CT值制作標準曲線,從而得到樣本的拷貝數(shù)。以GAPDH作為內(nèi)參照,TrkAⅠ/Ⅱ和TrkAⅢ作為目的基因,通過目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的

6、比值進行樣本間相對定量的比較。
　　 四、統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結(jié)果用(x±s)表示,各組間均數(shù)比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、方法的可靠性和準確性
　　 1、RNA的純度和質(zhì)量分析
　　 所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測,比值在1.8-2.0之間,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,條

7、帶清晰可見,無明顯降解。
　　 2、擴增的特異性及定量的準確性
　　 標準品cDNA經(jīng)梯度稀釋后進行PCR反應,制作標準曲線。得到的標準曲線相關(guān)系數(shù)(r2)均＞0.998,斜率在-3.3至-3.5之間,反映定量準確,擴增效率良好。擴增后溶解曲線顯示銳利的單一鋒,無其他非特異性鋒,說明擴增產(chǎn)物均一,無非特異擴增及引物二聚體。瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證擴增片段的均一性及長度。
　　 二、ATRA對SH-SY5Y細胞增殖

8、的影響
　　 對照組活細胞數(shù)隨著培養(yǎng)時間延長而增多,不同濃度ATRA組不同程度抑制了SH-SYSY細胞的增殖。ATRA對SH-SY5Y的生長抑制作用在0.1-10μmol/L濃度范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系。
　　 三、ATRA對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響
　　 不同濃度的ATRA均可誘導SH-SY5Y細胞產(chǎn)生形態(tài)學上的變化,對照組細胞分化百分率隨時間延長無明顯變化,各時間段間比較差異不顯著(F=2.889,P=0.0

9、79)。
　　 四、ATRA對SH-SY5Y細胞TrkA三種剪接異構(gòu)體表達的影響
　　 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,TrkAⅠ/Ⅱ mRNA表達水平增加與ATRA濃度及作用時間呈正相關(guān)。TrkAⅢ mRNA表達增加與ATRA濃度及作用時間呈負相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 ATKA對SH-SY5Y細胞生長抑制作用呈明顯的時間和劑量依賴關(guān)系,1.0μmol/L的ATRA對細胞形態(tài)有顯著影響,隨時間延長細胞出現(xiàn)明