EGCG通過減輕氧化應(yīng)激與抑制NALP3炎性體對阿霉素腎病有保護(hù)作用.pdf

1、研究背景和目的
　　局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是腎病綜合征(NS)常見而嚴(yán)重的病理表現(xiàn),也是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的重要原因之一。由于其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前臨床治療仍是一大難題。近來研究認(rèn)為,炎癥因子的大量激活以及氧化應(yīng)激作用的產(chǎn)生對FSGS的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。NALP3(NLR family pyrin domain containing-3 protein, NRLP3, NALP3)炎性體是NLRs炎性

2、體家族成員之一,主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、DCs等抗原遞呈細(xì)胞,發(fā)揮啟動炎性體裝配的作用。當(dāng)危險信號作用于靶細(xì)胞,NALP3炎性體被激活,通過募集 ASC,激活 caspase-1剪切 IL-1家族成員前體成為具有活性的IL-1β、IL-18促炎癥細(xì)胞因子,從而啟動炎癥反應(yīng)。研究表明,NALP3炎性體及其下游炎性因子在慢性腎臟疾病中發(fā)揮重要作用,在 FSGS腎病患者組織標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)NALP3mRNA的表達(dá)顯著升高,且與腎功能惡化程度顯著相關(guān)。

3、而另一方面,氧化應(yīng)激的發(fā)生可引起腎組織發(fā)生壞死、凋亡、炎癥以及纖維化已得到廣泛的共識。通過動物模型發(fā)現(xiàn),與對照相比,FSGS大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平明顯上升,抗氧化酶水平降低,并且與病情程度存在明顯相關(guān)性。因此,有效減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激作用對減緩FSGS向終末期腎臟疾病發(fā)展具有尤為重要的意義。
　　新近研究表明,作為綠茶中茶多酚的主要活性物質(zhì),表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有很強(qiáng)的生物活性。近年來研究發(fā)現(xiàn),EGCG具

4、有抗炎、抗感染、抗氧化、抑制腫瘤信號通路等作用。而其通過其抗炎、抗氧化,對改善腎組織炎癥、減輕組織損傷、保護(hù)殘腎功能方面有積極意義。雖目前未見有關(guān)EGCG治療FSGS的相關(guān)報道,但我們推測EGCG可以通過減輕炎癥反應(yīng)及抑制氧化應(yīng)激作用,減緩FSGS病程進(jìn)展速度。
　　本實(shí)驗(yàn)擬觀察FSGS患者腎組織NALP3等炎癥因子的表達(dá),以及EGCG對阿霉素(ADM)誘導(dǎo)的 FSGS小鼠腎組織 NALP3炎性復(fù)合體及氧化應(yīng)激作用的影響,探討EG

5、CG對阿霉素誘導(dǎo)的腎病小鼠腎組織的保護(hù)作用及機(jī)制,最終為臨床腎病綜合征的治療方法選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法
　　1.臨床標(biāo)本有關(guān)實(shí)驗(yàn)
　　收集26例我科臨床診斷為腎病綜合征患者經(jīng)腎活檢確診為FSGS的腎組織石蠟切片,以16例腎錯構(gòu)瘤患者手術(shù)切除的錯構(gòu)瘤周圍正常腎組織標(biāo)本為對照組,免疫組化檢測腎組織NALP3/ASC/caspase-1、IL-1β、IL-18、F4/80的表達(dá)情況,對腎小管間質(zhì)損傷程度進(jìn)行評分,收

6、集患者治療前24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮、血漿總蛋白、血漿白蛋白等生化指標(biāo),計算腎小球?yàn)V過率eGFR。將NALP3/ASC/caspase-1和IL-1β、IL-18表達(dá)情況分別與腎小管間質(zhì)損傷程度及各生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.動物實(shí)驗(yàn)
　　8周齡雄性BALB/C小鼠24只,隨機(jī)分為:①正常對照組(N組,6只),實(shí)驗(yàn)全程每天雙蒸水0.2ml灌胃,5天后生理鹽水(0.1ml)尾靜脈注射,2周后再重復(fù)注射生理鹽水,第一

7、次注射后28天開胸腹取血及腎臟標(biāo)本;②阿霉素腎病模型組(AN組,6只),實(shí)驗(yàn)全程雙蒸水灌胃,5天后給予10mg/kg阿霉素(生理鹽水配成2mg/ml)經(jīng)尾靜脈注射,2周后再重復(fù)注射同等劑量的阿霉素,第一次注射后28天按對照組方法取血和腎臟標(biāo)本;③小劑量EGCG處理組(EGCG A組,6只),實(shí)驗(yàn)全程經(jīng)50mg/kg.bw EGCG灌胃,后按AN組方法造模,第一次注射后28天按對照組方法取標(biāo)本;④大劑量EGCG處理組(EGCG B組,6只

8、),實(shí)驗(yàn)全程經(jīng)100mg/kg.bw EGCG灌胃,5天后按AN組方法造模,第一次注射后28天按對照組方法取標(biāo)本。PAS染色觀察腎組織損傷程度及炎性細(xì)胞浸潤程度,檢測小鼠血肌酐、血尿素氮、血清白蛋白、24h尿蛋白等生化指標(biāo),檢測腎組織MDA、CAT、GPx、SOD等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo),免疫熒光檢測腎組織NALP3、HO-1表達(dá)情況,western-blot法檢測腎組織NALP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、Nrf2

9、、HO-1蛋白表達(dá)情況,對數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1臨床研究:
　　1.1.與對照組相比,FSGS組患者腎組織NALP3/ASC/caspase-1、IL-1β、IL-18、F4/80表達(dá)顯著增加(P<0.01)。
　　1.2.相關(guān)性分析表明,NALP3、ASC、caspase-1的表達(dá)與IL-1β、IL-18均呈正相關(guān)(P<0.01),NALP3、ASC、caspase

10、-1、IL-1β、IL-18與腎小管間質(zhì)損傷程度積分、F4/80表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.01),與24h尿蛋白量、血肌酐濃度呈正相關(guān)(P<0.05),與 eGFR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與尿素氮、血漿總蛋白、血清白蛋白濃度無明顯相關(guān)性。
　　2動物實(shí)驗(yàn):
　　2.1. EGCG對阿霉素小鼠病情的影響。
　　阿霉素組小鼠較正常對照小鼠24h尿蛋白、血肌酐、尿素氮水平明顯升高(P<0.05),血漿白蛋白明顯降低(P<0.

11、05)。經(jīng)50mg/kg EGCG和100mg/kg EGCG處理后在注射阿霉素的小鼠,其24h尿蛋白、血肌酐、尿素氮的升高程度顯著低于AN組(P<0.05),血漿白蛋白的降低程度顯著低于AN組(P<0.05)。腎組織切片PAS染色顯示:AN組小鼠出現(xiàn)腎小球局灶節(jié)段性硬化(2.10±0.19),腎小管上皮細(xì)胞損傷(2.70±0.34)腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(2.70±0.34)等表現(xiàn);經(jīng)50mg/kg EGCG和100mg/kg EGCG處

12、理的小鼠,注射阿霉素后,腎小球硬化指數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、每高倍視野中性粒細(xì)胞數(shù)較AN組顯著減少(P<0.05)。
　　2.2. EGCG對阿霉素腎病模型小鼠腎組織炎性因子的影響。
　　應(yīng)用 western blot檢測各組小鼠腎組織炎性因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn),與正常對照小鼠相比,AN組小鼠腎組織 NALP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)明顯升高。經(jīng)EGCG處理的小鼠腎組織NALP3炎性體及其下游炎性

13、因子的蛋白表達(dá)較AN組顯著減弱(P<0.05),并且100mg/kg EGCG處理組較50mg/kg EGCG處理組小鼠腎組織炎性因子表達(dá)的減弱程度更加明顯(P<0.05)。
　　2.3 EGCG對阿霉素腎病模型小鼠腎組織氧化應(yīng)激作用的影響
　　AN組小鼠較正常對照小鼠腎組織抗氧化酶 SOD、CAT、CPx活性顯著降低、脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA含量顯著升高(P<0.05)。經(jīng)100mg/kg EGCG處理的小鼠注射阿霉素后腎組

14、織抗氧化酶 SOD、CAT、CPx活性的降低程度和脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物 MDA含量的升高程度顯著低于AN組(P<0.05)。采用western blot檢測各組小鼠腎組織具有抗氧化及保護(hù)作用的Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),經(jīng)EGCG處理的小鼠Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)水平較正常對照和單純阿霉素處理的小鼠腎組織均明顯升高(P<0.05)。
　　結(jié)論
　　1.NALP3炎性復(fù)合體及氧化應(yīng)激參與了FSGS的發(fā)生發(fā)展。