EGCG通過抑制內質網應激凋亡途徑減輕高糖致足細胞損傷.pdf

1、研究背景及目的:
　　糖尿病(diabetes，DM)發(fā)病率隨著當代生活方式的改變逐年增加，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，其患病率也隨之升高。在終末期腎衰竭(end-stage renal disease，ESRD)患者中由DN所占的比例也逐年增加。足細胞是不可再生的高度分化細胞，研究證明足細胞的損傷和凋亡在DN的發(fā)病和進展機制中占有重要地位。細胞在高糖環(huán)境下發(fā)生形

2、態(tài)和結構改變如肥大、足突分離、足細胞表面蛋白丟失、嚴重可致足細胞發(fā)生凋亡。其中凋亡與DN的發(fā)病機制密切相關。內質網是多功能細胞器，除參與機體物質合成代謝外，在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中也起著重要的調節(jié)作用。高糖、氧化應激等作用于內質網時，持續(xù)的有害因素會啟動內質網凋亡程序使細胞發(fā)生凋亡。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechi-3-gallate，EGCG)是綠茶中含有茶多酚，研究表明EGCG在腫瘤、腦血管病、冠心病等慢性疾病

3、發(fā)揮重要的預防作用。但EGCG是否對糖尿病腎病具有預防作用及是否具有保護足細胞的作用至今未見明確報道。在該實驗中通過高糖誘導足細胞，建立細胞凋亡模型，比較EGCG干預前后足細胞的增殖能力、足細胞表面蛋白Nephrin和WT-1的表達、足細胞的凋亡、內質網蛋白分子葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulatingprotein，GRP78)、磷酸化蛋白激酶樣ER激酶(p-double-stranded RNA likeendopla

4、smic reticulum kinase p-PERK)半胱氨酸天冬氨酸酶12(cysteinyaspartate-specific proteinases，Caspase-12)的表達情況。目的在于探究EGCG能否減輕高糖致足細胞的凋亡及是否通過內質網應激介導的凋亡途徑發(fā)揮對足細胞的保護作用。
　　研究方法:
　　細胞分組:①正常糖組（NG:5.6mmol/L葡萄糖）②甘露醇組(M:5.6mmol/L葡萄糖+24.4 m

5、mol/L甘露醇)③高糖組（HG:30mmol/L葡萄糖）④不同濃度的EGCG組（E1:1μmol/L+HG; E10:10μmol/L+HG; E20:20μmol/L+HG; E40:40μmol/L+HG; E60:60μmol/L+HG; E80:80μmol/L+HG;E100:100μmol/L+HG)分別培養(yǎng)24h，48h，72h用CCK8檢測細胞增殖情況，根據細胞增殖結果將其分為四組進行后續(xù)實驗①正常糖組(NG:5.6m

6、mol/L葡萄糖)②甘露醇組（M:5.6mmol/L+24.4 mmol/L甘露醇）⑧高糖組（HG:30mmol/L葡萄糖）④E20組(20μmol/L+HG)培養(yǎng)72h后Western-blotting檢測足細胞表面蛋白Nephrin和WT-1的表達，流式細胞技術以及Hoechst染色檢測細胞凋亡，Western-blotting檢測內質網應激介導的凋亡途徑中標志性蛋白分子GRP78、p-PERK、Caspase-12的表達。

7、　　結果:
　　1.足細胞的增殖:高糖刺激足細胞24h，48h，72h后，足細胞的增殖能力隨著時間增加而降低，并且細胞在培養(yǎng)72h后更為明顯。EGCG組在高糖環(huán)境下能夠促進足細胞的增殖，并且EGCG的濃度為20μmol/L培養(yǎng)72h后對促進足細胞的增殖更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.足細胞的損傷:各組細胞培養(yǎng)72h后，足細胞表面蛋白分子Nephrin和WT-1在HG組的表達明顯的低于NG組和M組(P＜0.

8、05);與HG組相比，E20組足細胞Nephrin和WT-1表達增加(P＜0.05)。
　　3.足細胞的凋亡:流式細胞術顯示:HG組足細胞的凋亡率(22.48％)明顯高于NG組(0.55％)和M組(0.72％)(P＜0.05)，而E20組細胞的凋亡率(6.57％)明顯低于HG組(P＜0.05); Hoechst染色顯示:NG組和M組足細胞核形態(tài)大小一致、核質均勻，HG組足細胞的細胞核則呈現固縮變小或花瓣狀等典型的凋亡形態(tài)改變，E2