軟骨寡聚基質(zhì)蛋白基因薄膜對(duì)干細(xì)胞分化影響的研究.pdf

1、背景:生物材料表面涂層已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于優(yōu)化不同醫(yī)療器械的表面性能。生物活性分子的沉積以及材料表面機(jī)械性能的優(yōu)化可以有效的調(diào)控細(xì)胞行為和命運(yùn)。在材料表面沉積基因組分可以維持長(zhǎng)時(shí)間的生物學(xué)功能，是非常有應(yīng)用價(jià)值的方法之一。因此，表達(dá)VEGF、BMP2等生長(zhǎng)因子的基因常被用來(lái)修飾材料表面以促進(jìn)成骨分化和骨形成。但是，基因功能化的材料促進(jìn)生理性腱骨愈合鮮有研究。COMP作為纖維軟骨中重要的非膠原蛋白類細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)細(xì)胞分化及維持軟骨表型起到了重

2、要作用。COMP基因結(jié)合材料表面修飾技術(shù)可能可以發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。
　　第一部分 HA/DNA多層薄膜的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建HA/DNA基因多層薄膜并表征，檢測(cè)基因多層薄膜的穩(wěn)定性及生物學(xué)活性。
　　方法:采用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建基因多層薄膜，通過接觸角檢測(cè)對(duì)材料最外層親疏水性能進(jìn)行評(píng)估;通過檢測(cè)DNA的特征性紫外吸收來(lái)監(jiān)測(cè)薄膜的組裝進(jìn)程;用掃描電子顯微鏡觀察不同層數(shù)薄膜表面的微觀結(jié)構(gòu);通過PBS緩沖液模擬生理?xiàng)l件檢

3、測(cè)薄膜穩(wěn)定性;通過胰蛋白酶溶液檢測(cè)薄膜的可降解性;將構(gòu)建的基因薄膜與HEK293T細(xì)胞共培養(yǎng)，通過綠色熒光蛋白表達(dá)水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及其與薄膜層數(shù)的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.隨著透明質(zhì)酸和DNA層的交替組裝，材料表面的接觸角也在30°到10°之間交替波動(dòng);
　　2.隨著薄膜層數(shù)的不斷增加，260nm處DNA特異性吸光度也增強(qiáng);
　　3.掃描電鏡下空白基底非常光滑，而(HA/DNA)4薄膜呈現(xiàn)出松散粗糙的微觀結(jié)構(gòu)，

4、(HA/DNA)8薄膜表面則相對(duì)更加致密平整;
　　4.基因薄膜在PBS緩沖液中很穩(wěn)定，但是在胰蛋白酶溶液中DNA能迅速地被釋放出來(lái);
　　5.基因薄膜能成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)染效率隨著薄膜層數(shù)的增加而提高。
　　結(jié)論:本研究通過層層自組裝技術(shù)成功地構(gòu)建了HA/DNA多層基因薄膜，該基因薄膜在生理?xiàng)l件下很穩(wěn)定，在酶存在時(shí)能迅速釋放出來(lái)，且該基因薄膜能成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具有生物學(xué)活性。基因薄膜的這些特性為其應(yīng)用于生物體

5、內(nèi)提供了基礎(chǔ)。
　　第二部分 HA/COMP多層薄膜對(duì)MSCs分化的影響
　　目的:構(gòu)建HA/COMP基因多層薄膜，檢測(cè)該基因薄膜對(duì)MSCs成骨、成軟骨分化的影響。
　　方法:采用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建HA/COMP基因多層薄膜，本研究以含軟骨寡聚基質(zhì)蛋白目的基因的基因薄膜為實(shí)驗(yàn)組，以含空載質(zhì)粒DNA的基因薄膜為陰性對(duì)照組。將該基因薄膜與MSCs共培養(yǎng)，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，通過RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化過程中目的基因、成骨

6、相關(guān)基因及成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平，并進(jìn)行相關(guān)的成骨、成軟骨細(xì)胞染色以評(píng)估分化進(jìn)程。
　　結(jié)果:1.買驗(yàn)組目的基因COMP mRNA的表達(dá)水平顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)，且這種高表達(dá)水平持續(xù)了至少14天;
　　2.成骨誘導(dǎo)過程中，實(shí)驗(yàn)組成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組有不同程度的降低;
　　3.成軟骨誘導(dǎo)過程中，實(shí)驗(yàn)組成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組有不同程度的提高;
　　4.實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶染色及