新型姜黃素類似物EF24體外抗腫瘤活性的氧化調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文新型姜黃素類似物EF24體外抗腫瘤活性的氧化調(diào)節(jié)機(jī)制姓名：譚欣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：王深明20091125中山大學(xué)博上學(xué)位論文新型姜黃素類似物EF24體外抗腫瘤活性的氧化調(diào)節(jié)機(jī)制中文摘要1EF24對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，凋亡和血管生成的影響姜黃素(1100pM)，EF24(0530gM)分別作用于乳腺癌細(xì)胞MCF7及卵巢癌細(xì)胞IGROVI，24及72d時(shí)后以MTS法(96孔板接種)或SRB法(24孔

2、板接種)檢測(cè)活細(xì)胞密度，繪出天然姜黃素及其合成物EF24對(duì)于各腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制曲線。應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling，TUNEL)觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞凋亡終末剪切酶caspase3的活化以及凋亡拮抗蛋白Bel2的表達(dá)變化。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EnzymeLinkedlmmunoSorbentAss

3、ayELISA)檢測(cè)培養(yǎng)液上清VEGF分泌水平，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞VEGF轉(zhuǎn)錄水平變化。2體外氧化應(yīng)激與腫瘤細(xì)胞血管生成及細(xì)胞增殖的相互作用在體外培養(yǎng)的MCF7及IGROVl細(xì)胞系中，以過(guò)氧化氫模擬氧化應(yīng)激，應(yīng)用直接抗氧化劑N乙酰絲氨酸(NAeytylCysteine，NAC)，問(wèn)接抗氧化劑叔丁基氫醌(tertbutylhydroquinone，tBHQ)以及姜黃素和EF24對(duì)細(xì)胞做預(yù)處理，檢測(cè)培養(yǎng)液上清中VEGF分泌的變化。熒光探

4、針標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)姜黃素及EF24處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ReactiveOxygenSpecies，ROS)的生成；以ROS清除劑超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)預(yù)處理細(xì)胞，觀察EF24的細(xì)胞毒效應(yīng)是否與ROS的水平相關(guān)。3EF24與抗氧化反應(yīng)元件體外共轉(zhuǎn)染抗氧化反應(yīng)元件(AntioxidantResponseElementARE)報(bào)告基因載體及內(nèi)參J嘏pRL

5、TK質(zhì)粒，應(yīng)用姜黃素及EF24治療MCF7及IGROVl細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(DualLueiferaseReporterassayDLR)觀察化合物基于ARE的抗氧化反應(yīng)機(jī)制。分離核漿蛋白，WesternBlot檢測(cè)藥物處理下核因子相關(guān)因子肭妮的核內(nèi)轉(zhuǎn)位。4Elf24抗氧化作用機(jī)制與抗血管生成的聯(lián)系應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小干擾RNA(smaUinterferingRNAsiRNh)技術(shù)敲除ARE激活通路中的關(guān)鍵細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子朋妮，