NOD2通過調(diào)控TRPC6離子通道的表達(dá)及活性參與高同型半胱氨酸血癥引起的腎損傷.pdf

1、研究目的:同型半胱氨酸是體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其代謝異常所導(dǎo)致的高同型半胱氨酸血癥是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)，以及心血管疾病并發(fā)癥導(dǎo)致的終末期腎病發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子，但是高同型半胱氨酸所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制迄今尚未完全明確。NOD2(nucleotide binding oligomerzation domain 2)屬于模式識(shí)別受體(pattern-recognition

2、 receptors，PRRs)家族中的NLRs(NOD-like receptors，NLRs)亞家族成員，在免疫調(diào)控與炎性反應(yīng)中起著重要的作用，前期研究證實(shí)其在腎臟多種細(xì)胞中表達(dá)并且有實(shí)驗(yàn)證明小鼠NOD2缺失對(duì)腎臟缺血再灌注和糖尿病腎病中具有保護(hù)作用。TRPC6(transient receptor potential cation channe 6，TRPC6)是具有鈣離子高選擇性的瞬時(shí)電位陽(yáng)離子通道，作為足細(xì)胞裂孔膜的重要組成蛋

3、白之一，其過度活化可致足細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和功能障礙，引起腎小球疾病發(fā)生。但是，高同型半胱氨酸血癥中，NOD2是否參與了腎損傷的發(fā)生發(fā)展，及其是否與TRPC6存在調(diào)控關(guān)系并參與此病理過程，至今尚未見報(bào)道。為此，本課題分別從體內(nèi)和體外兩方面探討在高同型半胱酸血癥中，細(xì)胞內(nèi)固有免疫受體NOD2在腎小球硬化中的作用以及對(duì)TRPC6的調(diào)控機(jī)制，為防治高同型半胱氨酸癥導(dǎo)致的終末期腎病提供新的治療策略。
　　研究方法:<

4、br>　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):NOD2在高同型半胱氨酸血癥引起腎損傷中的作用及調(diào)控機(jī)制
　　1.1、高同型半胱氨酸血癥引起的小鼠腎損傷以及NOD2表達(dá)變化:實(shí)驗(yàn)采用健康成年雄性CBS+/-(strainname:B6.129P2-CbstmlUnc/J)小鼠和野生型雄性C57BL/6J小鼠。隨機(jī)分成四組，每組10只，野生型正常飲食組，野生型飲食葉酸缺乏組，CBS+/-小鼠正常飲食組和CBS+/-小鼠飲食葉酸缺乏組。高效液相色譜法(hig

5、h performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)各組血漿中總同型半胱氨酸含量，以評(píng)價(jià)模型是否復(fù)制成功;酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)尿白蛋白/肌酐水平;采用PAS染色觀察腎臟的形態(tài)學(xué)變化和電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;ELISA檢測(cè)相關(guān)致炎因子和趨化因子的水平。分別采用定量RT-PCR、蛋白免疫印跡法和免疫組織熒光化學(xué)法，檢測(cè)NOD

6、2在小鼠腎皮質(zhì)以及腎小球足細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　1.2、NOD2在高同型半胱氨酸血癥腎損傷中的作用及對(duì)TRPC6通道的調(diào)控機(jī)制研究:采用健康成年雄性NOD2-/-(strainname:B6.129S1-Nod2tm(l)Flv/J)小鼠和野生型雄性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分成四組，每組10只，野生型正常飲食組，野生型飲食葉酸缺乏組，NOD2-/-小鼠正常飲食組和NOD2-/-小鼠飲食葉酸缺乏組。采用免疫組化法觀察腎小球TRP

7、C6和nephrin的表達(dá);其他生化與形態(tài)指標(biāo)，包括血漿總同型半胱氨酸含量、尿白蛋白肌酐水平、腎小球和足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、致炎因子和趨化因子在小鼠腎皮質(zhì)中的表達(dá)檢測(cè)及TRPC6和nephrin的表達(dá)檢測(cè)等，方法同上。
　　2.體外實(shí)驗(yàn):NOD2對(duì)TRPC6通道的調(diào)控及小鼠足細(xì)胞損傷中的作用
　　體外培養(yǎng)腎小球上皮細(xì)胞（足細(xì)胞），并經(jīng)同型半胱氨酸刺激后，分別利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)足細(xì)胞中NOD2、TRPC

8、6和nephrin的表達(dá)變化;MDP誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)NOD2活化，以及高同型半胱氨酸刺激轉(zhuǎn)染shRNA-NOD2質(zhì)粒獲得的NOD2基因沉默足細(xì)胞后，重復(fù)檢測(cè)上述指標(biāo)。采用流式細(xì)胞術(shù)分析上述各實(shí)驗(yàn)組中足細(xì)胞的凋亡情況，激光共聚焦觀察細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)變化，鈣成像技術(shù)記錄足細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分析TRPC6通道電流變化;為探討TRPC6和nephrin在信號(hào)路徑中的作用和相互關(guān)系，通過轉(zhuǎn)染shRNA-TRPC6質(zhì)?；虺聊?/p>

9、細(xì)胞中的TRPC6，在同型半胱氨酸干預(yù)下，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和骨架蛋白的結(jié)構(gòu)變化，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得過表達(dá)nephrin的足細(xì)胞，檢測(cè)其在Hcys刺激下TRPC6的蛋白表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):NOD2在高同型半胱氨酸血癥引起的腎損傷中的作用及調(diào)控機(jī)制
　　1.1、高同型半胱氨酸血癥引起的小鼠腎損傷以及NOD2表達(dá)變化:
　　首先，HPLC法檢測(cè)結(jié)果顯示野生葉酸缺乏組和CBS+/-葉酸缺乏組血漿總同

10、型半胱氨酸水平均明顯高于正常飲食組(＞10μmol/L)，表明高同型半胱氨酸血癥小鼠模型復(fù)制成功;尿白蛋白/肌酐比率與血漿總同型半胱氨酸水平呈正性相關(guān);PAS染色可見正常飲食小鼠腎小球，基底膜清晰，粗細(xì)均勻，腎小球血管袢薄而清晰，而葉酸缺乏組小鼠腎小球均不同程度地呈現(xiàn)基底膜粗細(xì)不均，系膜增生，PAS陽(yáng)性物質(zhì)沉積;通過電鏡觀察，足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)基底膜厚薄不均，局部膨出，足細(xì)胞次級(jí)足突融合，CBS+/-葉酸缺乏組小鼠腎小球基底膜內(nèi)容物外漏

11、，腎小球?yàn)V過屏障功能受損。以上結(jié)果表明，高同型半胱氨酸血癥引起了腎小球損傷。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在高同型半胱氨酸血癥中，腎皮質(zhì)中小鼠NOD2蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加;采用足細(xì)胞marker蛋白Synaptopodin和NOD2共定位，免疫熒光共聚焦顯示高同型半胱氨酸血癥中，腎小球足細(xì)胞中NOD2蛋白高表達(dá);并且小鼠腎皮質(zhì)白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細(xì)

12、胞間粘附分子-1(ICAM-1)的水平增高，表明高同型半胱氨酸血癥中腎皮質(zhì)的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。
　　1.2、NOD2在高同型半胱氨酸血癥所致腎損傷中的作用及對(duì)TRPC6的調(diào)控機(jī)制研究:
　　血漿總同型半胱氨酸水平的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，葉酸缺乏飲食復(fù)制高同型半胱氨酸血癥模型成功，雖然葉酸缺乏飲食導(dǎo)致NOD2-/-小鼠與野生小鼠的血漿tHcys無(wú)顯著性差異，但是NOD2基因敲除明顯降低了高同型半胱氨酸血癥中的尿白蛋白/肌酐比率，一定程度上

13、緩解了小鼠腎功能障礙;形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明NOD2基因敲除顯著減輕了高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致的腎小球損傷，并且發(fā)現(xiàn)腎小球基底膜膨出少見，足細(xì)胞次級(jí)足突排列較整齊，逆轉(zhuǎn)了高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致的小鼠腎小球足細(xì)胞損傷。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)小鼠腎小球TRPC6表達(dá)升高，而NOD2基因敲除能夠有效地抑制高同型半胱氨酸導(dǎo)致的TRPC6高表達(dá)和致炎因子以及趨化因子的產(chǎn)生;相反的，NOD2基因敲除一定程度上恢復(fù)了高同型半胱氨酸血癥所致的

14、nephrin表達(dá)。上述結(jié)果說(shuō)明，高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致的腎損傷過程中，NOD2參與了對(duì)TRPC6和nephrin的表達(dá)的調(diào)控。
　　2.體外實(shí)驗(yàn):NOD2對(duì)TRPC6通道的調(diào)控及小鼠足細(xì)胞損傷中的作用
　　同型半胱氨酸誘導(dǎo)了體外培養(yǎng)足細(xì)胞中NOD2、TRPC6的表達(dá)，導(dǎo)致OAG作用下的足細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加，并且通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TRPC6通道電流幅度的顯著升高。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)具有高靈敏度和高分辨率的特點(diǎn)，電流

15、可精確至1pA，空間和時(shí)間分辨率能達(dá)到1μm和10μs，實(shí)驗(yàn)采用特異性通道激動(dòng)劑OAG開放足細(xì)胞膜上TRPC6通道，記錄全細(xì)胞電流，能夠精確地反應(yīng)足細(xì)胞膜上TRPC6的通道數(shù)和開放概率。同樣，MDP活化足細(xì)胞NOD2后檢測(cè)到上述各指標(biāo)相同的變化趨勢(shì)，而NOD2基因沉默后，同型半胱氨酸導(dǎo)致足細(xì)胞的上述變化被有效的抑制，表明同型半胱氨酸導(dǎo)致的足細(xì)胞TRPC6表達(dá)是NOD2依賴性的，并且NOD2參與調(diào)控同型半胱氨酸引起的TRPC6通道依賴性的

16、鈣信號(hào)通路;激光共聚焦觀察進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NOD2活化和同型半胱氨酸均導(dǎo)致了足細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而TRPC6基因沉默與NOD2基因沉默結(jié)果一致性地改善了同型半胱氨酸導(dǎo)致的足細(xì)胞骨架重構(gòu)，并且足細(xì)胞凋亡也明顯受到抑制;同時(shí)，nephrin在足細(xì)胞中的表達(dá)由于NOD2活化或同型半胱氨酸被抑制，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中高同型半胱氨酸NOD2-/-小鼠腎皮質(zhì)nephrin水平高于其他實(shí)驗(yàn)組相呼應(yīng);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得nephrin過表達(dá)的足細(xì)胞則有效降低了Hcys

17、誘導(dǎo)的TRPC6的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，NOD2介導(dǎo)的nephrin依賴性的TRPC6信號(hào)路徑參與了同型半胱氨酸引起的足細(xì)胞損傷過程。
　　結(jié)論與創(chuàng)新性:
　　1.本課題在高同型半胱氨酸血癥中，首次表明NOD2參與了對(duì)TRPC6離子通道的調(diào)控，提示TRPC6介導(dǎo)的鈣離子信號(hào)路徑是連接固有免疫受體NOD2和腎損傷的一條重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，針對(duì)NOD2信號(hào)路徑中各級(jí)分子的靶向治療有可能成為臨床防治高同型半胱氨酸血癥相關(guān)的終末期腎病的新的