人參內(nèi)生真菌對人參毛狀根生長及次生代謝的影響.pdf

1、人參(Panax ginseng C.A.Mey.)是五加科人參屬植物，其干燥根和根莖同名入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是我國常用傳統(tǒng)中藥。味甘、微苦，性微溫。歸肺、脾、心、腎經(jīng)，具有大補元氣，補脾益肺，生津止渴，安神益智等功效?，F(xiàn)代臨床主要用于治療心氣虛證、冠心病、心律失常等疾病，是應用最廣泛、研究最深入的中藥之一，主要分布在我國遼寧東部、吉林東部和黑龍江東部?，F(xiàn)代研究表明，人參含有人參皂苷、氨基酸及揮發(fā)油等成分。其中公認的有

2、效成分主要是人參皂苷，可分為三類:一是五環(huán)三萜類的齊墩果烷型皂苷——人參皂苷Ro;二是原人參二醇型的四環(huán)三萜類達瑪烷型皂苷——人參皂苷Rh2、Rg3、Rb1、Rb、Rc;原人參三醇型的四環(huán)三萜類達瑪烷型皂苷——Re、Rf、Rg1。利用發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes侵染宿主植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的細胞可以誘導其產(chǎn)生大量的人參毛狀根。毛狀根與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)技術相比，是更為理想的生產(chǎn)次

3、生代謝產(chǎn)物的植物組織，因為其具有生長周期短、遺傳性狀穩(wěn)定以及激素自養(yǎng)型等特點。人參毛狀根是一種激素自養(yǎng)型的植物組織培養(yǎng)物，通過調(diào)控而改變其次生代謝產(chǎn)物的積累是較有意義的。因此以人參毛狀根為平臺，為人參皂苷類和人參多糖類次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)開辟了一種新的途徑。
　　本課題以我國重要藥用植物人參Panax ginseng C.A.Mey.和西洋參Panaxquinquefolius L.的內(nèi)生真菌作為研究對象，以人參毛狀根為研究平臺，篩

4、選得到能夠與人參共培養(yǎng)并促進宿主植物生長及有效成分含量積累的內(nèi)生真菌;通過形態(tài)及分子鑒定確定目標菌種的種屬;通過高效液相色譜技術研究人參毛狀根活性成分的變化;通過免疫熒光染色技術研究人參內(nèi)生真菌侵染宿主植物的過程;通過RT-RCR技術研究人參皂苷代謝途徑中關鍵酶基因的變化。期望初步探討人參內(nèi)生真菌影響人參毛狀根的機制，為揭示內(nèi)生真菌影響中藥材品質(zhì)及其機制提供實驗基礎和科學依據(jù)。主要研究結果如下:
　　1.采用傳統(tǒng)分離方法從吉林省通

5、化市栽培3年人參、4年人參、4年西洋參根中分離得到內(nèi)生真菌83株，根據(jù)形態(tài)合并為55個形態(tài)型;采用HPLC篩選到了一株能夠能與人參毛狀根共培養(yǎng)，并提高人參毛狀根生物量和人參皂苷Re、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg3含量的內(nèi)生真菌3R-2，通過形態(tài)和分子鑒定為普通裂褶菌(Schizophyllum commune)，為下一步研究人參內(nèi)生真菌對人參毛狀根的影響提供了目標菌株。
　　2.將人參內(nèi)生真菌3R-2菌絲通過打孔的方式加入到人參毛

6、狀根培養(yǎng)液中，考察3R-2菌絲對人參毛狀根生長和次生代謝成分生物合成的影響。結果表明在3R-2菌絲與人參毛狀根共培養(yǎng)的7天內(nèi)，3R-2菌絲對人參毛狀根的生物量、人參皂苷Rg2和人參皂苷Rg3的含量無顯著影響，在14-21天內(nèi)有顯著的促進作用;3R-2菌絲與人參毛狀根共培養(yǎng)的14天時，人參皂苷Re的含量達到最高。
　　3.為了去除3R-2菌絲的毒力作用以考察3R-2對人參毛狀根的影響，我們將3R-2菌絲的水溶性提取物作為誘導子研究其

7、對人參毛狀根生長和人參皂苷類次生代謝成分生物合成的影響，結果表明，與中劑量濃度的3R-2誘導子共培養(yǎng)21天后，人參毛狀根的鮮重、人參皂苷Rg2的含量和人參皂苷Re的含量的含量相比其他組別更高，因此確定中劑量濃度為最佳濃度。
　　4.通過對長白山產(chǎn)栽培人參和人參毛狀根組織的包埋切片和HE、六銨銀及免疫熒光染色，觀察到栽培基地新鮮人參根、莖、葉、果組織切片在顯微下的形態(tài)及內(nèi)生真菌的存在，發(fā)現(xiàn)莖和果組織中的菌斑最為明顯;觀察到幾株重要內(nèi)

8、生真菌對人參毛狀根組織的侵染情況，發(fā)現(xiàn)其主要侵染部位是周圍的薄壁細胞。為將來研究內(nèi)生真菌對植物組織的侵染途徑提供一定的實驗基礎。
　　5.通過對人參皂苷次生代謝途徑中4個關鍵酶基因HMGR、SS、SE和DS的rtPCR，結果表明，活菌絲體組的關鍵酶基因SS在第6天時顯著高于對照組且達到最高，而誘導子組的關鍵酶基因HMGR、SE和DS在第15天時達到最高值，且分別是對照組的90倍、20倍和120倍以上。
　　6.本研究通過代謝