慢性房顫心房重構(gòu)及蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)是臨床上十分常見的一種心律失常，其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，其主要臨床危害是增加血栓栓塞的危險(xiǎn)，有著很高的致殘率，而且長(zhǎng)期快速的心室反應(yīng)可導(dǎo)致心動(dòng)過(guò)速性心肌病，甚至引發(fā)惡性室性心律失常，危及生命。目前認(rèn)為房顫的發(fā)生和維持與多發(fā)子波折返、局灶觸發(fā)驅(qū)動(dòng)、心房電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及神經(jīng)體液因子的變化等有關(guān)，是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，其中最為根本的是心房的電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，即心房肌細(xì)胞的電生理特性及相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，但是

2、其具體的發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明，需要進(jìn)一步研究。房顫的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸離不開機(jī)體整個(gè)內(nèi)環(huán)境的改變，特別是機(jī)體中各種功能蛋白質(zhì)的變化，房顫的發(fā)生和維持歸根結(jié)底是機(jī)體中多種蛋白質(zhì)共同作用的結(jié)果。目前的研究多局限于單一或少數(shù)幾種基因或蛋白質(zhì)的變化，未能從整體上去把握其全貌。蛋白質(zhì)組的概念是指基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，更為清楚的表述是細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定的時(shí)間和空間上基因組活躍表達(dá)的蛋白質(zhì)。其中具有重要意義的疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究，主要是通過(guò)比較和分析正

3、常與異常組織細(xì)胞、同一疾病不同發(fā)展時(shí)期細(xì)胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定、定量、表征，尋找與疾病相關(guān)的新標(biāo)志物，為人類疾病研究提供新的手段和依據(jù)，還可以作為治療和藥物開發(fā)的靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)為二維電泳、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)，目前已具備高通量分析和鑒定蛋白質(zhì)的能力。因此，本課題擬通過(guò)建立家兔的慢性房顫動(dòng)物模型，進(jìn)一步觀察房顫時(shí)心房電生理特性及結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從整體水平系統(tǒng)比較心房肌細(xì)胞及血清在

4、房顫時(shí)與正常竇性心律時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，建立兩者差異譜，篩選與房顫密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步闡明房顫的發(fā)生機(jī)制提供新線索。本課題擬分三部分進(jìn)行，第一部分為：慢性房顫動(dòng)物模型的建立及心房重構(gòu)的初步觀察；第二部分為：慢性房顫心房肌細(xì)胞及血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究；第三部分為：慢性房顫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的再驗(yàn)證。 第一部分：慢性房顫動(dòng)物模型的建立及心房重構(gòu)的初步觀察 目的：探討以高頻率起搏刺激心房建立家兔慢性心房顫動(dòng)模型的方法并觀察心房

5、重構(gòu)現(xiàn)象。 方法：30只家兔隨機(jī)分為左心房組(10只)、右心房組(10只)及對(duì)照組(10只)，左心房組及右心房組均予開胸植入高頻率起搏器(1000次/分)并起搏刺激30天，左心房組電極置于左心房心外膜，右心房組電極置于右心房心外膜，對(duì)照組亦植入起搏器但不起搏。術(shù)后定期監(jiān)測(cè)起搏、心房顫動(dòng)的發(fā)生情況、房顫時(shí)心室率變化，測(cè)定起搏前及房顫發(fā)生后心房有效不應(yīng)期(AERP)的變化，術(shù)后30天，對(duì)照組及左心房組發(fā)生房顫(大于3周)的家兔取左心

6、房組織作電鏡檢查，觀察心房超微結(jié)構(gòu)變化情況。 結(jié)果：左心房組術(shù)后第7天，7只(70％)兔發(fā)生了房顫，2周時(shí)共有8只(80％)發(fā)生了房顫并能穩(wěn)定維持(與右心房組比較，P＜0.05)，30天時(shí)仍示房顫，其余2只兔至30天時(shí)仍呈起搏心律，而右心房組則僅有3只發(fā)生了房顫，對(duì)照組則未發(fā)生任何心律失常情況。心房顫動(dòng)時(shí)的心室率最初明顯增快(P＜0.05)，隨后有所降低(P＜0.05)，但仍高于基礎(chǔ)心室率(P＜0.05)。家兔左心房AERP短于

7、右心房，房顫后左心房AERP縮短，AERP頻率適應(yīng)不良，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比有顯著性意義。電鏡結(jié)果顯示，左心房組發(fā)生房顫(大于3周)后心房肌細(xì)胞線粒體腫脹，其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常。 結(jié)論：長(zhǎng)期高頻率起搏刺激家兔左心房是建立慢性房顫模型的有效方法，房顫后出現(xiàn)心房重構(gòu)現(xiàn)象。 第二部分：慢性房顫心房肌細(xì)胞及血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的：研究慢性房顫家兔心房肌細(xì)胞及血清蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，尋找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)并分析其與房顫的相互關(guān)

8、系。 方法：采用長(zhǎng)期高頻率起搏刺激家兔左心房心外膜的方法制作慢性房顫模型，術(shù)后30天，取房顫時(shí)間大于3周的家兔(6只)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)取6只已植入起搏器但未起搏的家兔作為對(duì)照組，比較這兩組心房肌細(xì)胞及血清蛋白表達(dá)的差異；取左心房游離壁(包括左心耳)組織進(jìn)行酶解分離心房肌細(xì)胞，利用超聲波破碎細(xì)胞提取蛋白，血清標(biāo)本則采用心臟直接穿刺采血法收集；雙向電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，進(jìn)行凝膠圖像分析比較，確定差異蛋白點(diǎn)，然后利用質(zhì)譜(MALDI-T

9、OF-MS)及生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定；最后登陸NCBI的protein網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein&itool=toolbar)，尋找相關(guān)蛋白質(zhì)的資料，分析其與心房顫動(dòng)的可能關(guān)系。 結(jié)果：心房肌細(xì)胞中鑒定出4個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)，即縫隙連接蛋白40、熱休克蛋白70、鈣調(diào)磷酸酶及肌球蛋白輕鏈2；血清中鑒定出1個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)鐵

10、蛋白，4個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)分別為補(bǔ)體C3前體、激肽原1、內(nèi)皮素1和結(jié)合珠蛋白；功能分析顯示這些蛋白質(zhì)與房顫有著一定的關(guān)系。 結(jié)論：慢性房顫家兔心房肌細(xì)胞中有4個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)分別為縫隙連接蛋白40、熱休克蛋白70、鈣調(diào)磷酸酶及肌球蛋白輕鏈2，血清中鑒定出1個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)鐵蛋白，4個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)分別為補(bǔ)體C3前體、激肽原1、內(nèi)皮素1和結(jié)合珠蛋白，這些蛋白質(zhì)與房顫可能有著密切關(guān)系。 第三部分：慢性房顫差異表達(dá)蛋

11、白質(zhì)的再驗(yàn)證 目的：對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出的部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行再驗(yàn)證，并進(jìn)一步分析其與房顫的相互關(guān)系。 方法：采用長(zhǎng)期高頻率起搏刺激家兔左心房心外膜的方法制作慢性房顫模型，術(shù)后30天，取房顫時(shí)間大于3周的家兔(6只)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)取6只已植入起搏器但未起搏的家兔作為對(duì)照組；采用免疫印跡技術(shù)(Westernblot)檢測(cè)左心房肌細(xì)胞中的縫隙連接蛋白40(Cx40)的表達(dá)，同時(shí)采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)縫隙連接蛋白40的表達(dá)

12、和分布。 結(jié)果：Westernblot及免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)果均顯示Cx40在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)高于對(duì)照組(0.53±0.09vs0.27±0.05，P＜0.01)，且分布發(fā)生改變，在對(duì)照組中Cx40排列規(guī)整，呈線狀分布于心肌細(xì)胞之間端一端連接的閏盤處，而在實(shí)驗(yàn)組中Cx40排列紊亂，異常分布于心房肌細(xì)胞的側(cè)邊、細(xì)胞漿中與細(xì)胞核周圍，僅少量呈線狀位于閏盤。 結(jié)論：慢性房顫可引起縫隙連接蛋白40表達(dá)量增加且分布發(fā)生改變，提示縫隙連接

13、蛋白40可能參與了房顫的發(fā)生和維持，與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析結(jié)果一致，證明蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是準(zhǔn)確可靠的。 通過(guò)以上研究，我們認(rèn)為長(zhǎng)期高頻率起搏刺激家兔左心房是建立慢性房顫模型的有效方法，心房顫動(dòng)可導(dǎo)致家兔發(fā)生心房重構(gòu)，提示心房重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的一個(gè)重要機(jī)制。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們鑒定出了4個(gè)上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞蛋白質(zhì)和5個(gè)差異表達(dá)的血清蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能均參與了房顫的發(fā)生和維持，提示房顫的發(fā)生可能是多種機(jī)制、多種蛋白質(zhì)、多環(huán)節(jié)共同