FrzA基因靶向轉導干預心肌細胞氧化損傷模型對于防治心力衰竭的研究.pdf

1、目的：以重組9型腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus serotyoe9,rAAV9）為載體介導 FrzA基因轉染心肌細胞氧化損傷模型，觀察是否能抑制心肌細胞Wnt通路表達活性，進而減輕心肌細胞凋亡，促進細胞存活。
　　方法：分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，免疫熒光法對心肌細胞進行鑒定。利用H2O2刺激心肌細胞建立心肌細胞氧化應激損傷模型，模擬體內心力衰竭狀態(tài)，MTT法檢測細胞活性及Annexin

2、V-FITC/PI雙染法檢測心肌細胞凋亡率，確定 H2O2最佳濃度。用啟動子為CMV的rAAV9載體攜帶目的基因轉染心肌細胞，流式細胞儀及Western blot測定細胞的轉染效率，確定rAAV9的最佳轉染效率。rAAV9介導FrzA基因轉染心肌細胞，Western blot檢測各組細胞Wnt通路關鍵分子蛋白的表達，RT-PCR檢測各組細胞Wnt通路關鍵分子 mRNA的表達。Western blot檢測各組細胞凋亡相關蛋白的表達，Ann

3、exinV-FITC/PI雙染法檢測各組心肌細胞凋亡率的變化。
　　結果：（1）免疫熒光結果顯示心肌細胞的純度可達到98％以上。（2）MTT與AnnexinV-FITC/PI雙染法結果顯示H2O2濃度對心肌細胞活性的影響是以劑量依賴的方式，隨著H2O2的濃度增加，心肌細胞活性降低，細胞凋亡率增高，應選擇濃度100μM的H2O2來建立心肌細胞氧化損傷模型。（3）Western blot結果均顯示rAAV9-CMV-eGFP可特異性轉

4、染心肌細胞，eGFP的表達高峰在第5天。流式結果顯示 rAAV9-CMV-eGFP-FrzA、rAAV9-CMV-eGFP轉染效率無差異。（4）Western blot及RT-PCR結果均顯示H2O2可有效激活Wnt信號通路，且FrzA基因轉染可抑制Wnt信號通路的活性。（5）Western blot及AnnexinV-FITC/PI雙染法結果顯示，H2O2激活Wnt信號通路后，細胞凋亡增多。而rAAV9介導FrzA基因轉導可有效減輕H