積雪草酸對小鼠心肌細胞凋亡和心力衰竭的保護作用及其機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一章 積雪草酸對乳酸誘導的心肌細胞損傷的保護作用及機制研究
　　目的:
　　研究積雪草酸(Asiatic acid,AA)對乳酸(Lactate)誘導的心肌細胞損傷的保護作用,并探討其可能的機制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)新生乳大鼠的原代心肌細胞,采用CCK-8法測定不同濃度AA(0、5、10、20、30μmol/L)和Lactate(0、2.5、5、10、20、

2、40mmol/L)對心肌細胞活力的影響。本實驗中采用Lactate(20mmol/L)刺激心肌細胞24h來建立心肌細胞Lactate損傷模型,研究AA(20μmol/L)預處理24h對心肌細胞Lactate損傷的保護作用和機制。
　　2.實驗分為4組:①正常對照組(Control組):不加Lactate和AA處理;②AA組:細胞中只加AA(20μmol/L)預處理24h;③Lactate組:細胞只加Lactate(20mmol/L

3、)處理24h;④Lactate+AA組:AA(20μmol/L)預處理24h,再加Lactate(20mmol/L)處理24h。
　　3.經DCFH-DA染色,用流式細胞儀檢測細胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)濃度。
　　4.經JC-1染色,用流式細胞儀和熒光顯微鏡觀測線粒體膜電位。
　　5.經Annexin V-FITC/PI染色,用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡。
　　6.經T

4、UNEL染色,熒光顯微鏡觀察心肌細胞凋亡。
　　7.提取心肌細胞胞質和線粒體蛋白,Western blot法檢測心肌細胞胞質Cytochrome c、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3以及線粒體單羧酸轉運蛋白1(Monocarboxylate transporter1,MCT1)等蛋白的表達。
　　結果:
　　1.Lactate(20mmol/L)刺激24h導致心肌細胞活力顯著下降,細胞

5、內ROS濃度顯著升高,線粒體膜電位顯著下降,心肌細胞凋亡率顯著增加,MCT1、Cytochrome c、Cleaved-caspase9和Cleaved-caspase3蛋白表達均顯著增加。
　　2.AA(20μmol/L)預處理24h顯著抑制乳酸誘導的心肌細胞損傷,降低細胞內ROS的生成,抑制線粒體膜電位的下降,降低心肌細胞凋亡率。并顯著增加線粒體MCT1蛋白的表達,降低Cytochrome c、Cleaved-caspase9

6、和Cleaved-caspase3蛋白的表達。
　　結論:
　　積雪草酸可以保護心肌細胞,其機制包括抑制氧化應激和線粒體凋亡通路活化,以及上調線粒體MCT1蛋白的表達。
　　第二章 積雪草酸對小鼠主動脈弓縮窄術后心力衰竭的保護作用和機制研究
　　目的:
　　研究積雪草酸（AA）對小鼠心力衰竭的保護作用，并探討其可能的保護機制。
　　方法:
　　1.采用C57BL/6小鼠，通過主動脈弓縮窄術(Tr

7、ansverse aortic coarctation，TAC)建立心力衰竭的動物模型，于術后第8周末使用心臟超聲檢測小鼠心室大小及心功能，處死小鼠后取出心臟，分離左心室，計算左心室重量/體重比(Left ventricular rweight/body weight,LVW/BW)。
　　2.實驗分為三組:①假手術組（Sham組）;②單純手術組（TAC組）;③TAC+AA組:TAC術后第5-8周，AA (100 mg/kg)灌胃

8、，每天一次。每組10只小鼠。
　　3.比色法測定心肌組織內乳酸和丙二醛(MDA)濃度。
　　4.經TUNEL染色，熒光顯微鏡觀察心肌細胞凋亡。
　　5.提取心肌細胞胞質和線粒體蛋白，Western blot法檢測心肌組織胞質Cytochrome c、Cleaved-caspase 9和Cleaved-caspase 3以及線粒體單羧酸轉運蛋白1(Monocarboxylate transporter 1，MCT1)等蛋

9、白的表達。
　　結果:
　　1.TAC術后8周小鼠心臟明顯增大，LVW/BW明顯增加，心超顯示出現明顯的心肌肥厚，同時心室腔明顯擴張，心功能明顯下降，出現心力衰竭。而AA治療后可以顯著降低TAC小鼠的LVW/BW，減輕心肌肥厚，抑制心腔擴張，改善心功能。
　　2.TAC術后8周小鼠心肌組織中乳酸濃度和線粒體MCT1表達均顯著增加。AA治療可以顯著降低TAC小鼠心肌組織內乳酸濃度，并進一步增加線粒體MCT1蛋白的表達。<

10、br>　　3.TAC術后8周小鼠心肌組織內MDA含量顯著升高，心肌細胞凋亡率顯著增加，線粒體凋亡相關蛋白（Cytochrome c，Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3）的表達也顯著增加。AA治療可以顯著降低TAC小鼠心肌組織內MDA含量和線粒體凋亡相關蛋白的表達，抑制心肌細胞凋亡。
　　結論:
　　積雪草酸可以抑制心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，其機制包括抑制氧化應激和線粒體凋亡通路活化，以及上調線粒