香菇（Lentinula edodes）菌絲不同發(fā)育形態(tài)差異表達(dá)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、香菇(Lentinula edodes(Berk．)Pegler)是著名的大型木腐真菌，在我國(guó)有已有800多年的栽培歷史。 香菇子實(shí)體的形成是香菇生活史中最復(fù)雜的發(fā)育過程，需要遺傳、環(huán)境、生理等因素的協(xié)同作用。在香菇子實(shí)體發(fā)育的起始階段中，菌絲首先在營(yíng)養(yǎng)逆境的脅迫下進(jìn)行局部地聚集而形成扭結(jié)體，隨后扭結(jié)體的密度逐漸增加而形成致密菌絲團(tuán)，致密菌絲團(tuán)最終發(fā)育為原基，原基本質(zhì)上是子實(shí)體的胚胎結(jié)構(gòu)。本文建立了適合香菇不同發(fā)育階段組織的RN

2、A高效提取方法，與其他常規(guī)RNA提取方法相比，該方法的獨(dú)特之處在于用有機(jī)溶劑抽提之前，加入了飽和Nacl溶液，從而促進(jìn)了多糖物質(zhì)與蛋白質(zhì)的去除，并提高了RNA的產(chǎn)量，為下游的分子生物學(xué)操作打下了基礎(chǔ)。另外，本文運(yùn)用mRNA差異顯示技術(shù)比較了香菇菌絲體、菌絲扭結(jié)體、致密菌絲團(tuán)以及原基等四個(gè)發(fā)育階段的基因表達(dá)差異。四個(gè)發(fā)育階段的組織提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后用隨機(jī)引物與錨定引物組合對(duì)cDNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行差異條帶的展

3、示。結(jié)果表明四個(gè)發(fā)育階段的基因表達(dá)差異不甚明顯，最終挑選了17個(gè)差異表達(dá)的ESTs基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序。通過與Gene Bank數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些ESTs片段涉及蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞壁的修飾、菌絲間的相互作用、碳氮源的代謝、物質(zhì)的運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞的復(fù)蘇等過程。其中，一個(gè)差異片段被證實(shí)為內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因，通過Real-time PCR定量分析，發(fā)現(xiàn)該基因在疏松菌絲體、菌絲扭結(jié)體和致密菌絲團(tuán)等三個(gè)階段的表達(dá)相對(duì)較低，而在原基發(fā)